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淫羊藿苷是中药淫羊藿的主要活性黄酮成分,具有显著的抗肝癌作用。课题组前期研究发现,淫羊藿苷口服到肠道后会被肠道酶（菌）水解为宝藿苷Ⅰ,且宝藿苷Ⅰ的肠道吸收和药理活性均优于淫羊藿苷,而在病理状态下由于肠道酶（菌）活力下降、数量减少会导致淫羊藿苷不能被有效水解为宝藿苷Ⅰ吸收,继而影响其药效发挥。针对上述问题,本论文提出以下两个解决方案:（1）采用固定化酶体外生物转化淫羊藿苷的方法高效获取吸收更好、活性更强的宝藿苷Ⅰ;（2）探索将固定化酶口服作为淫羊藿苷体内生物转化器的给药方式,促进淫羊藿苷在肠道实时酶解为宝藿苷Ⅰ吸收,提高抗肿瘤药效。因此,本研究分别制备了交联纳米SiO2固定化蜗牛酶和交联介孔硅SBA-15固定化β-葡萄糖苷酶,并对固定化酶的制备工艺、理化表征、最适酶解条件和酶学性能进行研究,建立了高效、稳定的淫羊藿苷体外生物转化工艺,为宝藿苷Ⅰ的绿色工业化生产奠定实验基础;此外还采用吸附-交联法制备了交联介孔硅SBA-15固定化纤维素酶,围绕其制备工艺、理化表征、体外酶解进行研究,并考察了固定化酶被灌胃给予小鼠后的体内荧光示踪分布行为,为促进淫羊藿苷的肠道实时酶解吸收、提高抗肝癌药效提供实验依据。本文主要研究内容如下:1.交联纳米SiO2固定化蜗牛酶体外转化淫羊藿苷研究以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）为氨基改性剂,以戊二醛为交联剂,采用共价偶联法制备交联纳米SiO2固定化蜗牛酶,并对其制备工艺、理化表征、最适酶解条件和酶学性能进行考察。结果表明,固定化蜗牛酶的最佳制备工艺为:SiO2/APTES投料比为3∶1,戊二醛质量分数为0.25%,酶载比为1∶3,固定化时间为6 h,该工艺条件下制备的固定化酶酶活为151.0μmol/h/g,酶活回收率为91.0%,载酶量为0.270 g/g,固定率为81.8%。TEM、FTIR、元素分析、热重分析结果均表明蜗牛酶被成功固定于交联纳米SiO2表面。固定化酶的最适酶解条件为p H 5.0,转化温度60℃,酶与底物质量比1∶2,转化时间12 h。酶解动力学参数Vmax为0.43μg/min,Km为0.78 mmol/L,重复使用5次后的剩余相对酶活仍能保持在70%以上,但热稳定性较游离酶没有显著提高。所制备的交联纳米SiO2固定化蜗牛酶具有较好的机械强度和酶学性能,重复利用多次后仍能保持良好的催化性能,总体酶解效率较游离酶大幅提高,可用于体外高效转化淫羊藿苷为宝藿苷Ⅰ。2.介孔SiO2固定化β-葡萄糖苷酶体外转化淫羊藿苷研究以β-葡萄糖苷酶为淫羊藿苷水解酶,以介孔SiO2SBA-15为固定化载体,以壳聚糖为介孔封堵剂,采用吸附-交联法制备交联SBA-15固定化β-葡萄糖苷酶,并围绕其制备工艺、理化表征、最适酶解条件及酶学性能进行研究。结果表明,固定化β-葡萄糖苷酶的最佳制备p H为6.0,固定化时间为8 h,酶浓度为7 mg/m L,壳聚糖加入量为0.1 mg/mg SBA-15,在此条件下制备的固定化酶的酶活为439.2μmol/h/g,酶活回收率为93.7%,载酶量为1.120 g/g,固定率为92.8%。TEM、SEM、FTIR及TGA结果表明酶被成功固定于介孔孔道内且不影响载体形貌。固定化酶最适酶解条件为p H 6.0,转化温度50℃,底物浓度0.5 mg/m L,转化时间8 h。酶解动力学参数Vmax为10.24μg/min,Km为16.15 mmol/L,酶经固定化后热稳定性明显提升,且在重复利用5次后,剩余相对酶活力仍保持在60%以上。所制备的交联SBA-15固定化β-葡萄糖苷酶具有制备工艺更简单、载酶量更高、酶学性能更好等优势,更适用于体外高效转化淫羊藿苷为宝藿苷Ⅰ。3.交联介孔SiO2固定化纤维素酶体外酶解淫羊藿苷研究以价廉易得的纤维素酶为淫羊藿苷水解酶,以介孔SiO2SBA-15为固定化载体,以壳聚糖为介孔封堵剂,采用吸附-交联法制备交联SBA-15固定化纤维素酶,并围绕其制备工艺、理化表征、体外酶解进行研究。结果表明,固定化纤维素酶制备的最佳p H为4.4,固定化时间为6 h,酶浓度为5 mg/m L,壳聚糖加入量为0.1mg/mg SBA-15,在此条件下制备的固定化酶的酶活为469.8μmol/h/g,酶活回收率为84.1%,载酶量为0.620 g/g,固定率为61.7%。TEM、SEM、FTIR、TGA及N2吸附-解吸附结果表明,酶被成功固定于介孔孔道内且不影响载体形貌。体外酶解结果显示,固定化纤维素酶在人工胃液和人工肠液中均保持较好的酶解活性,其与淫羊藿苷的最佳酶解质量比为4∶1。所制备的交联SBA-15固定化纤维素酶具有制备工艺简单、催化活力强、稳定性好、安全无毒等优势,可口服作为淫羊藿苷的体内生物反应器,促进淫羊藿苷在肠道实时酶解为宝藿苷Ⅰ吸收。4.交联介孔SiO2固定化纤维素酶的体内荧光示踪研究以FITC为荧光示踪剂,采用共价偶联法制备FITC标记的纤维素酶（FITC-Cel）,并将其固定在壳聚糖交联SBA-15上后,采用小动物活体成像-荧光示踪的方法对固定化FITC-纤维素酶（FITC-Cel-SBA-15）灌胃给予小鼠后的体内分布行为进行研究。结果表明,FITC-Cel制备成功并灌胃给予小鼠后,在胃肠道、肝、肾等组织均有明显的荧光信号,而FITC-Cel-SBA-15的荧光信号主要集中在胃肠道,且其在4 h离体胃肠道组织中的荧光强度显著强于FITC-Cel。证明所制备的交联SBA-15固定化纤维素酶具有较强的肠道滞留能力,有助于促进淫羊藿苷在肠道充分酶解为宝藿苷Ⅰ吸收,继而提高抗肝癌药效。