论文部分内容阅读
链霉菌具有复杂的形态分化周期及强大的次级代谢系统，可以合成许多广泛应用于医药与农业的重要次级代谢产物，而这些生理生化过程都受制于精细的调控系统。以天蓝色链霉菌为模式菌，研究其次级代谢调控因子及作用机制，将有助于深入认识链霉菌的代谢调控特性及网络，为工业菌株的代谢工程及合成生物学改造奠定良好的基础。本论文围绕这个主题，研究发现并鉴定了天蓝色链霉菌中一组对次级代谢进行差异调控的新型双组分系统(TCS)DraR-K(sco3063/3062)，对其分子调控机制进行了深入解析；同时，研究证实了DraR-K介导的差异调控机制在链霉菌属中相对保守的特点。 首先，对天蓝色链霉菌M145中draR-K基因缺失突变体的表型进行了详细分析。结果显示，当培养于丰富培养基(如R2YE和MS)上时，draR-K基因的同时缺失(△draR-K)或单个缺失(△draK和AdraR)都不会导致菌株出现明显的表型变化。但有趣的是，当突变株培养于添加了各种高浓度氮源的基本培养基(MM)上时，就表现出抗生素ACT产量大幅度减少，而RED产量却明显提高。这种表型变化随着氮源浓度(1，10至75mM)的增加而显著，说明DraR-K对抗生素合成的影响为条件依赖性，其功能受到高浓度氮源的诱导。并且，当培养于添加了高浓度谷氨酸钠(Glu)的MM上时，突变体中分泌的黄色色素yCPK也明显增加。这种由TCS介导的对不同抗生素生物合成的差异调控现象在链霉菌调控研究中尚属首次发现。另外，draR-K的缺失还导致突变体生长加快和形态分化异常。将draR-K基因重新导入突变体，可以完全回补表型变化。 随后，进行了DraR-K的调控机制研究。转录分析及EMSA实验表明，DraR-K通过分别直接激活actⅡ-ORF4和抑制kasO这两个途径特异性调控基因的转录而对ACT与yCPK的生物合成进行正负调控。然而，DraR-K对RED产量的影响却并不依赖于途径特异性基因redD/Z。此外，在不同氮源培养基上，DraR-K对ACT生物合成存在不同的调控模式：在含有谷氨酰胺(Gin)的MM上，DraR-K对ACT生物合成起主导作用；而在以Glu为氮源的MM上，DraR-K与另一双组分系统AfsQ1/Q2一起协同调控ACT的生物合成。采用DNase I footprinting及DNA定点突变实验，精确定位了DraR位于actⅡ-ORF4和kasO启动子区域的结合位点，推测这些结合位点相对于启动子-10与-35区的位置决定了差异调控作用；确定了DraR保守的DNA结合基序5-AMAAWYMAKCA-3’(M：A或C；W：A或T；Y：C或T；K：G或T)。基于该结合基序，预测和鉴定了DraR-K的regulon，并进一步揭示DraR-K通过影响初级代谢间接参与抗生素生物合成调控的可能途径。 为了全面了解DraR-K的调控功能，运用DNA芯片结合real-time qRT-PCR对出发菌株M145和突变株AdraR-K的转录表达谱进行了分析比较。结果显示，DraR-K除了对ACT、RED和yCPK的生物合成进行调控以外，还参与诸如coelibactin，carotenoids，desferrioxamines，geosmin及tetrahydroxynaphthalene等次级代谢产物生物合成的差异调控。同时，DraR-K也参与包括碳、磷和氮代谢在内的初级代谢调控。另外，芯片结果还初步揭示了draR-K突变体形态分化异常的可能原因。由此说明DraR-K在天蓝色链霉菌生理代谢及形态分化过程中起着全局性调控作用。 draR-K的同源基因广泛存在于不同链霉菌中。有趣的是，除虫链霉菌NRRL-8165中draR-K的同源基因draR-Ksav(sav_3481/3480)也表现出类似的对抗生素合成差异调控的作用。draR-Ksav的缺失可以导致阿维菌素产量大幅度提高，而寡霉素的产量却下降。这意味着由DraR-K介导的抗生素生物合成的差异调控机制在链霉菌中可能是相对保守的，这进一步揭示了链霉菌中次级代谢调控机制的多样性和复杂性。