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光学纯苯基乙二醇是液晶材料中重要手性添加剂和医药、农药及精细化工产品的重要手性中间体。本实验室已通过筛选得到一株可立体选择性转化外消旋体得到㈣-苯基乙二醇的菌株,近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)CCTCCM203011,并通过纯化得到催化其反应的(R)-专一性羰基还原酶((R)-specificcarbonylreductase,rCR)纯蛋白,本实验的目的就是在分子水平上对羰基还原酶基因(rcr)进行研究,为得到更高效的专一性酶类打下基础。
首先以近平滑假丝酵母CCTCCM203011基因组为模板,以rCR蛋白测序结果为依据设计引物,PCR扩增得到rcr全基因片断,将rcr连接入pMD18-TVector得到测序质粒pT-rCR,测序得到rcr全基因序列全长1011bp,其编码的蛋白序列具有336个氨基酸残基,计算分子量为35.9kD。通过对rcr基因的序列分析,鉴定了其3个功能域,分别为Adhzinc锌离子结合域,NAD+_Binding辅酶结合域以及GroEslike折叠腔域,此结果与纯蛋白性质相符合;并构建rcr基因的系统进化树。
构建表达质粒pTrc-rCR,并酶切检验;将pTrc-rCR转化大肠杆菌表达菌株,得到含目的基因的重组大肠杆菌E.coliJM109/pTrc-rCR;IPTG诱导重组蛋白的表达,SDS-PAGE分析得到重组蛋白表达条带;酶的活力测定显示E.coliJM109/pTrc-rCR/IPTG比活为0.294U/mg;其全细胞可还原α-羟基苯乙酮(α-hydroxyacetophenone)得到(R)-苯基乙二醇(97.5%e.e.,28%yield)。
通过摇瓶条件的研究,确定了重组蛋白的最佳诱导条件为:250mL的三角瓶中装液量20%,最适培养温度30℃,诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L,培养8hr开始诱导,诱导16hr结束培养。
以重组菌全细胞催化不对称还原反应,确定了重组菌的最佳反应条件为:最适反应pH7.0,最适反应温度30℃,以湿细胞状态参加反应,反应转速150r/min,反应时间48hr。底物浓度2%0;在反应体系中添加0.5%乙醇对反应有很大的促进作用,产物(R)-苯基乙二醇的e.e.值>98%,得率>80%。