背景与目的　　细胞凋亡是所有组织用来去除受损或多余细胞的必要生理过程。在对恶性肿瘤的深入研究中，人们发现正常上皮细胞的存活需要细胞外基质(ECM)的支持并给予存活信号。若上皮细胞脱离了ECM，细胞则会发生凋亡，这种形式的凋亡被称为失巢凋亡(Anoikis)。上皮来源的恶性肿瘤细胞发生转移的主要原因是由于迁移的过程中丧失了失巢凋亡(Anoikis)的特性。正是这一特性的丧失，使脱离了实体肿瘤的恶性细胞逃脱了发生凋亡的命运而继续存活，并进一步发生迁徙、浸润，形成转移瘤和异位癌。这一过程与胚胎着床发育的过程极其相似，发生这一现象的肿瘤细胞在一定程度上具有了与干细胞类似的某些生物学特性。　　干细胞特异性基因Oct-4属于POU转录因子家族，在维持干细胞的未分化状态和调节干细胞的分化过程起着关键性作用。胚胎形成过程中，一旦Oct-4基因表达异常，就会影响胚泡内层细胞团发育，最终导致胚胎死亡。体外培养的细胞，通过单一因子Oct-4基因的诱导表达，已成功转变为多能性干细胞。同时，Oct-4基因在多种恶性肿瘤的起源中起着一定作用。将Oct-4基因导入3T3细胞后，可以使部分细胞向恶性转化，并且Oct-4基因可能通过激活和上调其下游靶基因的表达，导致多种肿瘤的发生。　　Survivin，凋亡抑制蛋白家族（IAP）的一员，能够结合凋亡效应蛋白caspases并调节其功能，从而阻断凋亡过程。它在促进细胞增殖、抑制凋亡的平衡中起着重要的调控作用，也是生殖细胞产生与增殖、肿瘤转移浸润过程中基质黏附、新血管生成、上调原癌基因表达的重要调节因素，已成为靶向肿瘤基因治疗的重要目标之一。　　现有实验证实：敲除survivin基因可导致妊娠4～5天后的小鼠胚胎死亡。在降低小鼠胚胎细胞OCT-4表达时，Survivin基因启动子的活性会显著下降。而在肿瘤细胞株中Survinvin和Oct-4之间的是否存在同样关系尚未有报道。本课题基于此，着重探讨肿瘤细胞中Survinvin和Oct-4基因表达的调控机制。　　方法与结果　　本课题分为以下几部分研究内容：　　研究一：腺病毒重组质粒pSurv-shRNA的构建　　方法：在腺病毒载体的基础上，引入Survivin基因启动子，构建的腺病毒shRNA载体，测序正确后，用293T细胞进行重组，TCID50法测定病毒滴度。　　结果：重组腺病毒质粒pSurv-shRNA经酶切、测序鉴定正确，重组病毒滴度达到后续试验要求。　　研究二：肝胆肿瘤细胞转录因子Oct-4的表达对Survivin抗凋亡作用的调控研究　　方法：对临床原发性肝癌、胆囊癌、胆管癌标本Oct-4和Survivin的表达进行免疫组化鉴定；进一步建立肝癌、胆囊癌、胆管癌细胞系EHBH-H1、EH-GB1和EH-CA1，利用腺病毒携带Survivin-shRNA或Oct-4基因感染癌细胞系，利用流式细胞术观察细胞周期和细胞凋亡的变化，探讨转录因子Oct-4与Survivin之间的相互调控及对癌细胞遗传特性的影响。　　结果：临床原发性肝癌、胆囊癌、胆管癌标本Oct-4阳性率达60.7％，Survivin阳性率达75.0%，且两者之间存在明显的正相关关系；特异性shRNA沉默EH-CA1癌细胞Survivin表达后，其Oct-4表达没有变化，但诱导细胞周期发生阻滞和细胞凋亡；EH-GB1癌细胞获得Oct-4表达后，Survivin表达增强，促进了细胞周期运行并下调细胞凋亡。　　研究三：针对Oct-4和Survivin基因的双靶向shRNA腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞的抑制作用研究　　方法：根据GenBankNM001168的Survivin基因序列和DQ486513.1的OCT-4基因序列，设计相应的shRNA。酶切回收目的片段，插入到含有腺病毒同源序列和绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达盒序列的载体质粒pAd-EGFP中，并构建含双靶向shRNA的载体pDual-shRNA。用脂质体法转染293细胞得到重组腺病毒，鉴定正确后，扩增、纯化腺病毒，利用腺病毒携带特异性shRNA感染肝癌细胞系EHBH-H1，通过Westernblotting、MTT和裸鼠荷瘤试验检测Oct-4和Survivin基因的表达情况及瘤体体积变化。　　结果：酶切、测序证实特异性shRNA腺病毒表达载体构建成功。荷瘤试验显示有明显的肿瘤生长抑制作用（P<0.01）。　　结论　　1、Oct-4可以增强肿瘤细胞Survivin的表达，从而发挥促进细胞周期运行、抑制细胞凋亡的作用；　　2、利用Oct-4调节Survivin启动子的活性的特点，双靶向分子干预是更为有效的治疗策略。