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人类ankyrin repeat and suppressor of cytokine signaling box蛋白9(hASB9)是Elongin C-cullin-SOCS box(ECS) E3泛素连接酶复合物的一个亚基。它特异性识别底物蛋白脑型肌酸激酶(CKB),使其被泛素化修饰并在蛋白酶体的参与下被降解,从而降低细胞内CKB的水平。ASB9蛋白这种底物识别的特异性是由ankyrin repeat基序决定的;而其多泛素化的修饰则依赖于ASB9蛋白的SOCS box结构域。 ASB9-2是ASB9的剪接体,它只拥有一个ankyrin repeat结构域。在本研究中,我们在大肠杆菌中成功地表达并纯化了ASB9-2蛋白。采用汽相悬滴扩散法在16℃获得了蛋白质晶体,并收集得到分辨率为2.2(A)的X-射线衍射数据。ASB9-2晶体的空间群属于P4332晶系,其晶胞参数为a=b=c=129.25(A),α=β=γ=90°。该晶体每个不对称单位中仅含有一个ASB9-2分子,其MatthewsCoefficient参数(Vm)为2.81(A)3/Da,溶剂含量为56.3%。以人Ankyrin-R蛋白D34片段(PDB code1N11)的晶体结构作为模型,采用分子置换法解析得到了ASB9-2蛋白的晶体结构(PDB code2INL)。 人ASB9-2晶体结构由六个连续的ankyrin repeat基序,以及N-端的环状结构和C-端两个反向平行的α-螺旋,共14个α-螺旋组成,呈略微弯曲的1/6圆弧状。每个ankyrin repeat基序包含两个反向平行的α-螺旋,相邻的基序之间由一段较长的环状结构相互连接,形成了一种典型的L-型横切面。这种L-型的结构在ASB9-2分子的X-轴方向形成了一个凹槽,成为适合和其它蛋白接触的分子表面。每个ankyrin repeat中,内侧α-螺旋(α1)由8残基组成,而外侧α-螺旋(α2)有9个残基,内外α-螺旋之间这种1个氨基的长度差别和内侧α-螺旋之间的相互作用,造成ASB9-2整体上略微弯曲的结构。该蛋白晶体结构的解析对于理解ASB家族成员是如何特异性识别底物蛋白的起着重要的作用。 为了揭示ASB9-2蛋白和CKB的结合方式,我们尝试纯化了ASB9-2-CKB复合物蛋白,验证了复合物蛋白的稳定性,并进行了晶体的筛选。虽然在两个条件下长出了孪晶,但是未能验证它确实为ASB9-2-CKB蛋白晶体,同时也未能优化得到合适的晶体进行X-射线衍射分析。 因此,我们尝试通过原核蛋白的体外结合实验,来寻找ASB9-2参与结合CKB蛋白的位点。在利用GRAMM-X Protein Docking软件对ASB9-2和肌酸激酶CK(PDB code1GOW,和CKB的同源性:99%)结合方式进行预测的基础上,我们对ASB9-2蛋白的一些氨基酸残基进行了定点突变以研究它们在识别CKB中的作用。实验结果表明Leu78,Gly79与Ile45,Leu106,Phe107,Val111形成的疏水中心可能参与了和CKB蛋白的结合。而Trp104和L106两位点对蛋白的正确折叠,稳定结构的形成,起重要作用。同时为确定ASB9-2蛋白不同ankyrin repeat重复基序在结合CKB中所发挥的作用,我们利用体外pull down实验进行验证。结果表明它们的结合至少需要ankyrin repeat1-4及N-端loop区的同时存在。 另一方面,在AD293细胞中共同转染ASB9-2剪接体和全长ASB9-1蛋白,发现ASB9-2的存在能竞争结合细胞内的CKB,阻止其被ASB9-1识别而降解,从而在保持细胞内CKB的一定水平中起作用。 本论文主要对ASB9-2的晶体结构进行了研究。通过X-射线衍射分析,我们得到并解析了ASB9-2的晶体结构(PDB code2INL)。利用GST-pull down技术,验证ASB9-2蛋白和底物CKB的结合,是在其凹槽表面,有N-端环状结构和多个ankyrin repeat(1-4)参与,依靠电荷作用和氢键或疏水作用等共同作用实现。