肝癌主要指肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是我国常见的恶性肿瘤之一,它具有恶性度高、侵袭性强、进展快、预后差和死亡率高等特点。细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP)是一类位于内质网的亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族,参与多种内源性物质和外源性化合物的代谢。亚硝胺类、黄曲霉毒素、烟草和酒精等已被证实为肝癌风险因素,这些致癌物质在体内的转化代谢均有CYP酶参与。因此,深入研究CYP酶活性与肝癌的相关性是当今世界研究的重要课题。为了考察肝癌病人药物代谢的变化,支持临床合理用药,本课题以102例HCC病人非肿瘤肝组织为研究对象,105例正常非肿瘤肝组织为对照,系统地了考察了10种主要CYP酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5)对探针药物的体外代谢活性;测定了肝微粒体蛋白含量;分析了肝纤维化程度和基因多态性对CYP酶活性的影响,以期发现肝癌病人药物代谢的个体差异及影响因素,为临床个体化用药提供理论依据。方法1.伦理学声明本研究方案经郑州大学伦理委员会批准,受试者均已签署知情同意书。2.肝脏标本本研究收集的人肝标本均为常规手术切除的非肿瘤肝脏组织,标本来自河南省人民医院和河南省肿瘤医院。102例HCC病人,伴有HBV或HCV感染,肝标本经组织病理学证实伴有肝硬化或肝纤维化病变。105例对照组肝标本来自肝血管瘤、肝转移癌、胆石症和胆囊癌病人,肝功能正常,无HBV或HCV感染,经组织病理学证实肝标本为正常肝组织。所有肝标本在手术切除后经常规处理,于30分钟内置于液氮以备后期使用。HCC组中男性86例、女性16例,年龄范围29岁~75岁(53±11岁),吸烟者45例(占44.1%),饮酒者37例(占36.3%)。对照组中男性37例、女性68例,年龄范围20岁~75岁(48±10岁),吸烟者12例(占11.9%),饮酒者12例(占11.9%)。受试者均常规使用麻醉药,用药史显示近期未使用CYP酶诱导剂或抑制剂。肝组织经过固定、包埋、HE和Masson染色,根据Scheuer分级标准,按纤维化程度分为S1~S4期。其中,S1~S3期病变程度较轻,为肝纤维化;S4期病变程度较重为肝硬化。3.肝微粒体制备及蛋白测定采用低温差速离心法制备人肝微粒体(human liver microsomes,HLMs);肝微粒体蛋白浓度采用Bradford法测定;一氧化碳差示法测定总CYP含量和细胞色素b5(cytochrome b5,Cyt b5)含量;根据细胞色素c电子受体测定NADPH-P450还原酶(POR)活性;肝脏回收率为相同个体的肝微粒体POR活性与肝匀浆POR活性之比;每克肝脏的微粒体蛋白含量(value of microsomal protein per gram of liver,MPPGL)以肝微粒体浓度×体积/肝标本净重/肝脏回收率计算得到。4.基因分型本研究检测了在中国人群中发生频率超过1%的多态性位点,包括CYP酶的24个突变位点、以及POR的16个突变位点。其中CYP2E1*1C*1D基因型采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的一步PCR方法,通过测定产物片段长度确定。其余基因突变位点均采用质谱方法检测,通过检测两个不同突变所引起的单碱基延伸产物分子量的差异确定。5.10种CYP酶对探针底物的代谢活性采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)-紫外法(UV)或荧光法(FLD)测定探针底物的代谢产物浓度。非那西丁、香豆素、安非他酮、紫杉醇、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑分别作为CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的体外探针,底物的生物转化程度(TR)作为反应速度,Graph Pad Prism 5.0软件计算米氏常数(K m)和最大反应速度(V max),体外代谢内在清除率(CL int)由V max/K m比值得到。所建立的药物测定方法均在一定范围内呈现良好的线性关系(r>0.999);日内、日间变异均<15%;相对回收率均在85%~115%之间;底物稳定性良好,所建立的分析方法符合生物样本的测定要求。探针底物范围如下:非那西丁6.25~800μM,香豆素0.156~20μM,安非他酮7.8~500μM,紫杉醇2.5~80μM,甲苯磺丁脲31.25~2000μM,奥美拉唑3.9~500μM,右美沙芬2.5~640μM,氯唑沙宗7.8~500μM,咪达唑仑0.39~50μM。体系微粒体蛋白浓度为:CYP1A2、CYP2A6和CYP2E1均为0.3 mg·ml-1;CYP2D6和CYP3A4/5为0.2 mg·ml-1;CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19为0.5 mg·ml-1。预孵育时间均为37°C水浴5 min,孵育时间为CYP1A2、CYP2A6和CYP2E1均为30 min;CYP2B6和CYP2C9为60 min;CYP2C19为90 min;CYP2C8为120 min;CYP2D6为20 min;CYP3A4/5为5 min。孵育结束时加入20μl冰乙腈或10μl高氯酸沉淀或1 ml乙酸乙酯萃取终止反应。6.统计学分析正态性检验结果表明,人肝微粒体代谢底物的酶动力学参数呈非正态分布,故采用非参数检验进行数据分析。SPSS17.0对各项数据资料进行统计学分析,两组间参数比较采用两个独立样本检验,两组间等位基因分布比较采用卡方检验,检验水准α为0.05。结果1.肝脏标本的组织病理分级102例HCC肝标本中,S1~S4期分别有8、19、27、48例;其中有54例为肝纤维化(S1、S2、S3),48例为肝硬化(S4)。2.肝微粒体蛋白含量结果显示,102例HCC肝微粒体的总CYP含量、细胞色素b5含量、MPPGL的中位数(范围)分别为134.0(33.5~468.9)pmol·mg-1、293.2(109.7~506.3)pmol·mg-1和28.9(7.7~93.6)mg·g-1,POR活性为44.6(17.8~74.3)pmol·min-1·mg-1。与对照组相比,HCC肝微粒体总CYP含量、MPPGL、POR活性均显著性降低。3.10种CYP酶的代谢活性3.1肝微粒体水平的酶活性以每毫克肝微粒体蛋白为单位,CYP酶对探针底物的清除率代表肝微粒体水平的酶活性。HCC病人10种CYP的酶动力学参数(K m、V max和CL int)中位数(范围)分别为:CYP1A2为70.0(33.2~687.8)μM、521.5(68.6~2605.0)pmol·min-1·mg-1及7.8(0.29~42.8)μl·min-1·mg-1,个体差异为20~147倍。CYP2A6为3.6(0.58~17.6)μM、522.8(0.73~2880.0)pmol·min-1·mg-1及145.4(0.26~260.0)μl·min-1·mg-1,个体差异为30~3945倍。CYP2B6为108.7(46.9~1198.0)μM、78.0(15.0~237.9)pmol·min-1·mg-1及0.71(0.049~4.5)μl·min-1·mg-1,个体差异为15~91倍。CYP2C8为23.4(9.5~235.5)μM、13.5(4.7~112.3)pmol·min-1·mg-1及0.63(0.035~4.0)μl·min-1·mg-1,个体差异为23~114倍。CYP2C9为204.6(60.1~773.1)μM、319.1(61.9~903.2)pmol·min-1·mg-1及1.5(0.08~4.5)μl·min-1·mg-1,个体差异为12~56倍。CYP2C19为71.6(28.8~275.5)μM、101.8(21.5~268.4)pmol·min-1·mg-1及1.4(0.22~3.9)μl·min-1·mg-1,个体差异为9~17倍。CYP2D6为30.7(7.8~273.5)μM、172.4(37.8~560.4)pmol·min-1·mg-1及6.9(0.49~54.7)μl·min-1·mg-1,个体差异为14~111倍。CYP2E1为60.3(24.3~91.3)μM、1238.0(151.0~4858.0)pmol·min-1·mg-1及20.9(4.1~53.2)μl·min-1·mg-1,个体差异为3~32倍。CYP3A4/5为2.6(1.1~8.0)μM、1205.5(332.4~4602.0)pmol·min-1·mg-1及524.8(73.8~1099.8)μl·min-1·mg-1,个体差异为7~14倍。与对照组相比,对于K m,HCC组中CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/5的K m均明显升高。对于V max,CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的值均升高,其中CYP2E1的V max增加了2.3倍;CYP1A2和CYP2C8的V max显著下降。对于CL int,CYP2C9、CYP2D6和CYP2E1的值显著升高、CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的CL int降低。其中CYP2C8的CL int下降尤为显著,比对照组降低了77%。3.2肝组织水平的酶活性以每克肝脏为单位,CYP酶对探针的清除率代表肝组织水平的酶活性。根据肝组织的MPPGL含量,由微粒体水平酶活性推导出肝组织水平的酶活性。HCC组10种CYP酶的V max和CL int中位数(范围)分别为:CYP1A2为13551.5(1110.7~158520.7)pmol·min-1·g-1及199.6(13.5~2436.9)μl·min-1·g-1。CYP2A6为14988.9(18.4~114723.7)pmol·min-1·g-1及3760.4(8.2~13285.9)μl·min-1·g-1。CYP2B6为2159.1(286.6~14008.3)pmol·min-1·g-1及19.7(0.63~98.9)μl·min-1·g-1。CYP2C8为408.4(63.0~2915.4)pmol·min-1·g-1及17.4(0.80~149.4)μl·min-1·g-1。CYP2C9为9037.1(816.2~37935.6)pmol·min-1·g-1及43.6(3.0~178.9)μl·min-1·g-1。CYP2C19为2816.3(260.3~11678.2)pmol·min-1·g-1及39.1(1.7~127.3)μl·min-1·g-1。CYP2D6为5300.4(332.3~28727.7)pmol·min-1·g-1及191.0(4.6~1711.0)μl·min-1·g-1。CYP2E1为34690.2(1155.1~113794.2)pmol·min-1·g-1及604.6(31.1~2024.8)μl·min-1·g-1。CYP3A4/5为31264.6(2666.7~143812.5)pmol·min-1·g-1及14644.2(1167.6~51938.0)μl·min-1·g-1。HCC组与对照组相比,对于V max,CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的V max均降低,CYP2E1的V max升高。对于Cl int,CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19和CYP3A4/5的Cl int均比对照组降低,CYP2E1的Cl int增加。3.3 CYP水平的酶活性以每pmol CYP亚型为单位,CYP酶对探针的清除率代表CYP水平的酶活性。根据肝脏微粒体总CYP含量,由微粒体水平活性推导出CYP水平的酶活性。HCC组10种CYP酶的V max和CL int中位数(范围)分别为:CYP1A2为3.9(0.30~31.3)pmol·min-1·pmol-1及0.06(0.002~0.52)μl·min-1·pmol-1。CYP2A6为3.7(0.004~43.0)pmol·min-1·pmol-1及0.90(0.002~4.2)μl·min-1·pmol-1。CYP2B6为0.58(0.03~3.3)pmol·min-1·pmol-1及0.005(0.0003~0.03)μl·min-1·pmol-1。CYP2C8为0.10(0.02~0.83)pmol·min-1·pmol-1及0.005(0.0001~0.04)μl·min-1·pmol-1。CYP2C9为2.3(0.33~12.5)pmol·min-1·pmol-1及0.01(0.001~0.08)μl·min-1·pmol-1。CYP2C19为0.62(0.046~3.6)pmol·min-1·pmol-1及0.0099(0.00099~0.05)μl·min-1·pmol-1。CYP2D6为1.2(0.14~7.7)pmol·min-1·pmol-1及0.044(0.001~0.49)μl·min-1·pmol-1。CYP2E1为8.3(1.1~48.4)pmol·min-1·pmol-1及0.15(0.023~0.67)μl·min-1·pmol-1。CYP3A4/5为9.1(1.1~57.6)pmol·min-1·pmol-1及3.5(0.49~13.5)μl·min-1·pmol-1。与对照组相比,HCC组中CYP2C8的V max显著降低,CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的V max均升高。对于CL int,CYP1A2和CYP2C8的V max均降低,CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的CL int均升高。4.CYP等位基因频率的分布对比HCC组和对照组,CYP2D6*10(100C>T)等位基因频率分布存在显著性差异。CYP2D6*10突变纯合子TT在HCC组的频率明显降低(16.7%vs.46.7%,P<0.01),而杂合子CT频率显著增加(46.9%vs.21.9%,P<0.01)。在HCC组内等位基因频率高低依照CT>CC>TT排次,而在对照组则相反,为TT>CC>CT。两个亚组(纤维化组和肝硬化组)分别与对照组相比,CYP2D6*10等位基因分布也存在显著差异。在纤维化组和肝硬化组中突变纯合子TT频率均比对照组显著降低,而杂合子CT频率显著升高。纤维化组与肝硬化组相比,CYP2D6*10等位基因频率存在显著差异,肝硬化组中突变纯合子TT频率比纤维化组显著降低(8.9%vs.23.9%,P<0.01)。5.CYP基因多态性对酶活性的影响结果显示在HCC组中,4种CYP基因多态性对酶活性产生影响。对于K m,CYP2D6*10(100C>T)的突变纯合子TT(125.1μM)、杂合子CT(30.4μM)分别与野生型CC(17.4μM)相比,K m均显著升高。V max的趋势与K m相反,TT(89.4 pmol·min-1·mg-1)及CT(155.6 pmol·min-1·mg-1)携带者均显著低于CC携带者的V max(241.5 pmol·min-1·mg-1)。对于CL int,TT(0.70μl·min-1·mg-1)、CT(6.9μl·min-1·mg-1)与CC(13.2μl·min-1·mg-1)相比,CL int均明显降低,其中较为显著的变化是TT携带者与CC携带者相比CL int降低了95%。CYP3A5*3突变纯合子*3*3的K m(2.3μM)、杂合子*1*3的K m(2.8μM)与野生型*1*1(3.9μM)相比,均显著降低。V max显示出与K m相同的趋势(*3*3<*1*3<*1*1)。对于CL int,*3*3(490.8μl·min-1·mg-1)、*1*3(542.0μl·min-1·mg-1)与*1*1(762.9μl·min-1·mg-1)相比,CL int均显著性降低。在HCC病人中未检测到CYP2C9*3突变纯合子*3*3基因型。杂合子*1*3比野生型*1*1的V max显著性降低(223.2 vs.326.5 pmol·min-1·mg-1,P<0.01)。同时,*1*3携带者(1.1μl·min-1·mg-1)比*1*1携带者的CL int(1.6μl·min-1·mg-1)显著降低(P<0.05)。CYP2B6(516G>T)突变纯合子TT的CL int和V max均低于野生型GG的CL int和V max。在对照组中,CYP2D6*10、CYP3A5*3及CYP2C9*3等三种基因突变对酶活性的影响较为显著,均引起CYP酶活性下降。HCC组与对照组相比,基因多态性对酶活性的影响基本一致,即CYP2D6*10、CYP3A5*3及CYP2C9*3等三种突变对酶活性具有显著的影响,突变均导致CYP酶代谢能力下降。6.POR基因多态性对CYP酶活性的影响以CL int代表CYP酶活性,在HCC组中POR基因多态性对CYP1A2、CYP2A6、CYP2C8、CYP2D6和CYP2E1活性具有影响作用。POR(rs10954732)杂合子GA与野生型GG相比,CYP2E1的CL int降低。POR(rs2286823)对CYP2E1有类似的影响,杂合子GA与野生型GG相比,CYP2E1的CL int降低。此外,POR(rs4732516)杂合子CG与野生型CC相比,CYP2D6的CL int更高,同时,突变纯合子GG与CG相比,CL int显著下降。POR(rs1057870)杂合子GA与野生型GG相比,CYP1A2的CL int升高。在对照组,POR基因突变对CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1活性产生影响。POR(rs1057868)杂合子CT比野生型CC的CYP2B6和CYP2C8的CL int更低;POR(rs3823884)杂合子AC比野生型AA的CYP2E1活性下降;POR(rs2286823)杂合子CT、突变纯合子TT均比野生型CC的CYP2E1活性降低。HCC组和对照组相比较,POR的基因多态性均对CYP2C8和CYP2E1活性产生影响;但在HCC组有更多的CYP同工酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6)活性受到POR基因多态性影响。7.肝组织纤维化程度对CYP酶活性的影响组织病理学结果显示,HCC病人的肝组织伴有肝纤维化或肝硬化病变。为了分析病变程度对CYP酶活性的影响,分别测定纤维化和肝硬化两个亚组的酶动力学参数(K m、V max和CL int)。与纤维化组相比,肝硬化组CYP2C8的K m升高、CYP2D6的K m降低。对于CL int,CYP2D6的CL int在两组之间存在差异,肝硬化组比纤维化组的CYP2D6CL int升高了53.6%(8.4 vs.3.9μl·min-1·mg-1,P<0.05)。与正常对照组相比,对于K m,纤维化组和肝硬化组中CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP2E1和CYP3A4/5的K m均升高;CYP2D6的K m在肝硬化组降低(21.4 vs.28.9μM,P<0.05)但在纤维化组无改变。对于V max,纤维化组和肝硬化组中CYP1A2和CYP2C8的值降低;CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4/5的值均升高。对于CL int,纤维化组和肝硬化组中CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19的CL int均降低;CYP2C9和CYP2E1的CL int均升高。不同的是,肝硬化组中CYP2D6的CL int比对照组升高(8.4 vs.3.5μl·min-1·mg-1,P<0.05),但纤维化组中CYP2D6的CL int无改变。8.人口学因素对CYP酶活性的影响以CL int代表CYP酶活性,分析了性别、吸烟、饮酒等因素对CYP酶活性的影响。在HCC组中,女性的CYP2A6活性比男性增加(164.1 vs.142.1μl·min-1·mg-1,P<0.05);与吸烟者相比,不吸烟者具有较高的CYP2D6活性(9.0vs.5.3μl·min-1·mg-1,P<0.05);不饮酒者相对饮酒者,CYP2D6的活性明显升高(8.5 vs.5.0μl·min-1·mg-1,P<0.05)。在对照组中,不吸烟者与吸烟者相比,CYP2D6的CL int降低(3.0 vs.5.7μl·min-1·mg-1,P<0.05)。HCC组与对照组相比,吸烟对两组的影响存在显著差异。吸烟的HCC病人比不吸烟者具有更低的CYP2D6活性,而在正常对照组中吸烟者具有较高的CYP2D6活性;性别和饮酒能够引起HCC病人CYP酶活性变化,但对正常对照组无显著影响。结论1.肝癌病人CYP酶的活性受到疾病影响而显著改变,CYP1A2、CYP2C8和CYP2C19活性降低,CYP2C9、CYP2D6和CYP2E1活性增加,CYP2A6、CYP2B6和CYP3A4/5活性无改变,且酶活性存在较大的个体差异。2.肝癌病人CYP2D6*10(100C>T)等位基因分布显著改变,突变纯合子TT频率降低,杂合子CT频率增加。3.肝癌病人肝微粒体蛋白含量显著降低,肝组织水平酶活性显著变化。4.CYP2D6*10、CYP2C9*3和CYP3A5*3等三种基因多态性对肝癌病人酶活性有显著的影响,基因突变引起酶活性降低。5.肝癌病人的肝组织硬化影响CYP2D6的活性而使其显著升高。