研究背景肺癌目前是我国死亡率最高的癌症之一,因其早期症状通常不明显,大多数病人发现时已是终末期,并伴随着淋巴结转移或远处器官的转移,所以失去了手术的机会。而目前对于肺癌的治疗方法较为局限,通常包括传统的放疗、化疗,靶向治疗及最新发现的PD-1单抗治疗。但各方面数据提示,目前对于肺癌的治疗手段有效率不高,肺癌平均五年生存率仍然低于其他类癌种,如乳腺癌,宫颈癌、前列腺癌等,所以寻找新的治疗手段显得尤为重要。免疫治疗仍为目前研究热点。但在肿瘤微环境中,免疫逃逸普遍存在。肿瘤抗原通常能逃脱机体的免疫监视,并且肿瘤细胞可以表达出一些负性免疫分子,如PD-L1的存在可以使得效应免疫细胞无效能。在肿瘤免疫的起始阶段,首先需要经过抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)的处理,摄取肿瘤抗原,然后再抗原递呈细胞内进行加工处理后,转运至细胞表面,从而激活T细胞,发挥功能。机体内功能最强的抗原递呈细胞为树突状细胞(dendritic cell,DC),未成熟的DC具有较强的吞噬功能,但抗原递呈能力较弱,若在肿瘤微环境内促进成熟DC细胞的比例,那么可以特异性的激活较多的T细胞,从而增强免疫,发挥抗肿瘤的作用。IL-15是由单核巨噬细胞和上皮细胞产生的细胞因子,现已有研究表明,它在刺激NK细胞活化上具有重要作用。目前多项关于IL-15的临床研究也正在进行。IL-15受体为三聚体,是由IL-15Rα,IL-2Rβ/IL-15Rβ 和IL-2y c/IL-15γ三个亚基组成的,因IL-15与IL-2共用β(CD122)和γc(CD132)两个亚基,所以认为其功能与IL-2功能相似。但是根据文献报道,IL-15通常能比IL-12发挥更强大的作用。其原因可能与它们的受体分配不同有关。IL-2α与IL-15α分配在不同的细胞,IL-2α主要表达于活化的B细胞和T细胞,而IL-15α主要表达于活化的DC和单核细胞。趋化因子是一类小分子蛋白质,它们在趋化细胞的迁移上发挥着重要的作用,有些趋化因子能与抗原递呈细胞相互作用。肺癌是一类对于放射治疗表现出中度敏感性的癌种,放疗在治疗肺癌上能起到一定的作用,但放疗治疗肺癌上目前还存在较多不足。此次研究,我们将放疗与细胞因子IL-15相结合,建立放射治疗协同免疫治疗的研究模型,增强放疗治疗肺癌的作用。研究目的1、在TCGA数据库中,分析肺癌病人及正常人进行IL-15的表达水平,并对于不同分期肺癌的IL-15表达水平进行进一步分析,在GEO数据库中分析癌组织及癌旁组织IL-15表达水平。2、在肺癌细胞中过表达IL-15,并对于是否成功构建过表达IL-15阳性组及阴性组进行检测,分别标记为并探讨腺病毒转染是否会对肿瘤细胞的性质造成影响。3、探讨在肺癌细胞中过表达IL-15是否能增高趋化因子的表达,从而促进DC细胞的成熟。4、探讨肺癌细胞中过表达IL-15是否能协同放疗增高趋化因子的表达。研究方法与内容1、TCGA数据库分析:从TCGA数据库中下载数据,将表达数据和生存数据整合,使用R语言自带的函数做差异分析,使用survival R包做生存分析;GEO数据库分析:在GEO中下载不同的数据集,对于肺癌病人中癌组织及癌旁组织的IL-15表达进行分析。2、IL-15过表达肺癌细胞株建立:分别用IL-15过表达腺病毒及阴性对照腺病毒感染将肺癌细胞株H460及A549进行腺病毒转染,48h后通过倒置荧光显微镜下观察感染效率,再提取RNA,用qRT-PCR检测IL-15RNA表达水平。收集细胞上清及细胞裂解液,用ELISA检测蛋白表达水平。3、腺病毒感染后细胞性质检测:用EDU、平板克隆实验对阳性病毒组、阴性病毒组、未转染病毒组肺癌细胞的增殖能力进行检测,并探讨腺病毒转染后是否影响肿瘤细胞性质。4、趋化因子表达检测:用qRT-PCR检测IL-15是否能促进趋化因子的表达,以及检测IL-15是否能协同放疗进一步增高趋化因子的表达。5、肿瘤细胞与DC细胞共培养:抽取正常供者外周血20ml,利用人淋巴细胞分离液对外周血细胞进行分离,离心后分离出单个核细胞,并用配制含有IL-4和GM-CSF的完全培养基,继续培养,第六天,收取DC,将转染阳性病毒、阴性病毒及未转染病毒的肿瘤细胞与未成熟DC进行共培养。24小时后,收取与肿瘤细胞共培养过的DC,运用流式细胞术检测DC成熟比例。研究结果1、IL-15在肺癌患者中低表达。使用R语言自带的函数对下载的TCGA数据进行分析,在正常人和肺癌患者之间存在明显表达差异(p<0.0001),即正常人中IL-15表达比肺癌患者高。再将数据根据肺癌分期进行分类,可以看到分期越晚,IL-15的表达水平逐渐降低。对GEO数据库进行的分析显示,在数据集GSE2514、GSE19804、GSE10072均可看到差异表达,癌组织中IL-15比癌旁组织表达低(p<0.001,P<0.01,P<0.05)。2、成功构建过表达IL-15的肺癌细胞株。肺癌细胞进行腺病毒转染后,48小时后放置于倒置荧光显微镜下观察,在蓝色光束的激发下,可见到细胞内带绿色荧光,与白片对比带绿色荧光细胞数较多,说明病毒转染效率高。qRT-PCR及ELISA结果证实腺病毒转染后IL-15在RNA水平表达及蛋白水平表达均上调。3、腺病毒转染未影响肿瘤细胞增殖。在转染阳性病毒、阴性病毒和未转病毒细胞中,EDU阳性细胞比例无统计学差异,单细胞克隆形成率也无统计学差异。4、IL-15促进趋化因子的表达,并协同放疗照射促进趋化因子表达。在过表达IL-15的肺癌细胞中,可以检测到趋化因子CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10的表达上调。放疗照射后1-5天,趋化因子的表达水平也发生变化,但放疗照射过表达IL-15的肺癌细胞后,结果提示趋化因子的表达进一步增高,比单独放疗照射升高趋势更明显,并能持续时间更久。5、过表达IL-15的肿瘤细胞与DC细胞共培养后,促进DC成熟。将转染阳性病毒肺癌细胞、转染阴性病毒组肺癌细胞,未转染病毒组肺癌细胞,单纯培养基组与DC细胞共培养,24小时后收取DC细胞,流式检测DC成熟比例,结果提示IL-15过表达组DC细胞成熟最多。6、过表达IL-15的肺癌细胞接受放疗照射后促进更多的DC细胞成熟将单纯培养基,未处理组肺癌细胞,过表达IL-15的肺癌细胞,转染了IL-15的肺癌细胞并且接受放疗照射后的细胞,与DC细胞进行共培养,流式检测DC成熟比例,结果提示转染了 IL-15并且接受放疗照射的肺癌细胞能促进更多的DC细胞成熟。研究结论1、正常人体内IL-15表达水平比肺癌患者体内的表达水平高,并随着肺癌临床分期越晚,IL-15表达越低。2、IL-15转染腺病毒后未影响肿瘤细胞的增殖。3、IL-15能增加趋化因子CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10的表达。4、IL-15能促进DC细胞成熟。5、IL-15能进一步上调放疗促进的趋化因子的表达。6、IL-15能协同放疗进一步增加DC细胞成熟。