波里马细胞质雄性不育(pol CMS)是甘蓝型油菜杂种优势利用的主要途径之一,同时也是研究核质互作的良好载体。本研究通过图位克隆的方法分离了波里马细胞质雄性不育的育性恢复基因Rfp,并利用细胞学和分子生物学方法对其进行了相关研究,阐述了Pol CMS的败育机理及Rfp基因在甘蓝型油菜中的恢复功能。主要研究结果如下:1.利用不育系6330A和恢复系Bing409构建的回交群体通过图位克隆的方法将波里马细胞质雄性不育恢复基因(Rfp)定位到甘蓝型油菜A9染色体上一段长约32kb的区间。对定位区间中的orf进行序列分析发现其中一个为PPR家族成员,将之作为候选基因构建载体。遗传转化证明该orf确实是波里马细胞质雄性不育恢复基因(Rfp)。2.对该基因的全长(包括启动子区,CDS和3,UTR)在不育系1141A和恢复系Bing409中进行比较测序,比较测序结果表明Rfp与rfp启动子区和3,UTR区分别个有一个SNP,而在CDS上存在45个SNP,导致30个氨基酸的改变,其中12个氨基酸的极性发生变化。亚细胞定位的结果显示Rfp和rfp均定位于线粒体。这表明恢复基因与其等位基因功能的差异主要是由于CDS区的变异导致,但这些变异并未引起蛋白定位的改变。基于上述的测序结果,开发了针对Rfp的功能标记,可以高效地用于波里马细胞质雄性不育恢复材料的筛选和恢复系的回交选育。3.半薄切片结果表明不育单株花药在发育至第5期不能形成四个正常的角隅,向后发育也不能形成药室或者形成1-2个形态异常的药室,而形成的药室中小孢子的发育异常,最终不能形成花粉或者产生干瘪的花粉。透射电镜结果表明不育单株在花药发育的第3期线粒体开始出现异常和崩解,可能引发孢原细胞的PCD,最终导致L2层细胞不能分化出正常的药室内壁,中层,绒毡层以及小孢子母细胞。4.对Rfp基因进行RT-PCR和qPCR分析,结果表明Rfp油菜的根、茎、叶、花和幼蕾各个组织中广泛表达,幼蕾中表达量最高,GUS分析结果与之类似,说明恢复基因可能主要在花药发育早期起重要功能。在花药中GUS染色结果表明Rfp表达的主要部位在L2层细胞特化出的药室内壁,中层,绒毡层以及小孢子母细胞(小孢子)中,这与不育表型相对应。5.为了探究Rfp可能的功能,以pol胞质(不育系)和nap胞质(保持系)线粒体组差异的orf作为探针进行Northern blot的检测。其中以orf224作为探针检测时发现在与不育系相比遗传转化复育系和恢复系中orf224-atp6转录本发生明显减少,而保持系中基本检测不到信号。这表明Rfp可能通过转录后调控的方式参与orf224转录本的加工从而恢复育性。6.对Rfp进行预测发现其具有15个PPR结构域,可能与RNA识别相关,但它本身不具有RNA剪切或者其他加工的结构域,据此推测可能还存在其他未知蛋白参与该过程。通过酵母双杂,在甘蓝型油菜花蕾cDNA文库中共筛选到了4个可能与Rfp互作的基因,通过BiFC的检测证实这些互作在甘蓝型油菜的线粒体中真实存在。对这些互作的基因进行了干涉,它们的具体功能需进一步研究。