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肾间质纤维化是多种慢性肾脏病(Chronic kidney diseases,CKD)进展至终末期肾病(End stage renal disease,ESRD)的共同病理改变,一旦进入ESRD,患者将面临昂贵的肾脏替代治疗费用,生活质量的显著降低和生存时间缩短等严峻问题。因此,找到新的抗纤维化治疗方法至关重要。慢性缺氧不仅是各种慢性肾脏病进展至终末期的共同通路,更重要的是它是肾小管间质损伤最重要的始动因素。近期研究表明,小管上皮细胞G2/M期阻滞,能够通过激活成纤维细胞并促进转录生长因子(Transcriptional growth factor–β1,TGF-β1)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF),Ⅳ型胶原α1(Collagen4A1,COL4A1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的分泌,导致肾脏纤维化[5-7],那么,在缺氧微环境下,肾小管上皮细胞是否也发生细胞周期阻滞进而促进纤维化呢?以及调控这一过程的具体分子机制是什么?都是亟待回答的问题。MiRNAs(micro RNAs,mi RNAs)是一类内源性的非编码核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA),它能够通过抑制靶基因的转录和翻译或者促进靶基因的降解调节基因表达,与肾间质纤维化关系密切。近年来,研究表明:缺氧能够诱导大量mi RNAs的表达并产生相应的功能。除此之外,一些研究也证明了有些mi RNAs参与细胞周期的调控。我们前期通过基因芯片筛选发现mi R-493在缺氧的HK2细胞中高表达,进一步在单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)模型及Ig A肾病(Ig A nephropathy,Ig AN)患者组织中也验证了mi R-493呈高表达。进一步,通过生物信息学预测分析发现,STMN1 3’-非翻译区(3’-Untranslated region,3’-UTR)存在mi R-493的潜在结合位点,而且它们的表达呈负相关。STMN1是细胞周期的调控子,能够编码stathmin1蛋白,通过调节微管的稳定性在有丝分裂纺锤体形成中发挥着关键的作用,即STMN1能够参与细胞周期的调控。由此我们推测,缺氧微环境下,mi R-493可能通过抑制STMN1介导了肾小管细胞周期G2/M期阻滞进而促进了肾间质纤维化,本研究将通过体内外实验证实这一推论。【目的】1)研究慢性缺氧在肾小管上皮细胞G2/M期阻滞及肾间质纤维化中的作用。2)研究mi R-493在慢性缺氧诱导的肾小管上皮细胞G2/M期阻滞及肾间质纤维化中的作用。3)缺氧微环境下mi R-493-STMN1通路在小管细胞G2/M期阻滞及肾间质纤维化中的调控作用。4)体内抑制mi R-493的表达,验证其逆转肾间质纤维化的作用。【方法】1)通过流式细胞术、Western Blot及免疫组化检测缺氧微环境下细胞周期改变及肾间质纤维化指标。2)通过q RT-PCR及原位杂交技术检测缺氧微环境下mi R-493的表达,然后在HK2细胞中转染mi R-493模拟物(mimic)及抑制物(inhibitor),通过流式细胞术及Western Blot法检测细胞周期改变及肾间质纤维化指标。3)通过荧光素报告基因、Western Blot及q RT-PCR验证mi R-493对STMN1的调控作用及机制。然后,在HK2细胞中转染STMN1-sh RNA体外抑制STMN1的表达,通过流式细胞术及Western Blot法检测细胞周期改变及肾间质纤维化指标。4)小鼠体内注射mi R-493 sponge AAV,通过q RT-PCR、免疫组化及Western Blot法验证下调mi R-493后对肾间质纤维化的逆转作用。【结果】1)慢性缺氧能够介导小管上皮细胞G2/M期阻滞及肾间质纤维化。首先通过流式细胞术检测缺氧处理的HK2细胞周期变化,发现G2/M期比例增加,进一步通过Western Blot法检测缺氧处理的HK2细胞及UUO模型发现:G2/M期标志(cyclin B1/cyclin D1)随缺氧及梗阻时间的延长表达增加,同时纤维化相关因子CTGF、COL4A1及α-SMA的表达增加。在UUO模型中,免疫组化结果显示:G2/M期标志(PH3/Ki67)在UUO 14d后升高,并且Masson染色显示肾间质纤维化程度增加,表明缺氧微环境能够介导小管上皮细胞G2/M期阻滞及肾间质纤维化。2)在缺氧微环境下mi R-493高表达,并且能够诱导小管上皮细胞G2/M期阻滞及肾间质纤维化。我们通过q RT-PCR检测缺氧处理的HK2细胞及Ig AN患者组织中mi R-493的表达,结果显示:与对照组比较,mi R-493高表达,且原位杂交术也显示mi R-493在UUO 14d后表达增加。然后,在HK2细胞中转染mi R-493mimic及inhibitor,通过流式细胞术及Western Blot发现:mi R-493mimic能够增加小管细胞G2/M期比例且促进纤维化相关因子的表达,相反,mi R-493 inhibitor能够逆转这一改变。3)mi R-493在转录后水平抑制STMN1的翻译,介导小管上皮细胞G2/M期阻滞及肾间质纤维化。首先,生物信息预测发现STMN1是mi R-493的靶基因,进一步通过荧光素报告基因验证了mi R-493能够直接调控STMN1。随后,通过转染mi R-493mimic检测STMN1的m RNA及蛋白水平发现:mi R-493在转录后水平抑制STMN1的翻译调控STMN1的表达。最后,在UUO模型中检测STMN1的表达发现:随梗阻时间增加表达降低;免疫组化及Masson结果显示:UUO 14d后,STMN1表达降低同时间质纤维化程度增加。体外转染STMN1 sh RNA抑制STMN1的表达发现:与对照组比较,转染STMN1 sh RNA后,G2/M期标志(cyclin B1/cyclin D1)表达增加,同时纤维化相关因子CTGF,COL4A1及α-SMA的表达增加。4)体内干预mi R-493的表达能够抑制肾间质纤维化。在小鼠体内,通过注射mi R-493 sponge腺相关病毒(Aeno-associated virus,AAV)抑制mi R-493的表达,结果显示:与对照组比较,mi R-493 sponge AAV能够降低纤维化相关分子α-SMA及COL4A1的表达,增加STMN1的表达,提示干预mi R-493的表达能够抑制肾间质纤维化。【结论】综上所述,我们研究表明mi R-493在缺氧微环境下高表达,并且能够通过抑制下游靶基因STMN1促进小管上皮细胞G2/M期阻滞及肾间质纤维化。即mi R-493-STMN1通路介导缺氧诱导的小管上皮细胞G2/M期阻滞促进肾间质纤维化。抑制G2/M期阻滞或者阻断mi R-493-STMN1通路将为探究新的抗纤维化治疗提供新视角。