论文部分内容阅读
胶原蛋白是生物体重要的结构蛋白,随着人年龄的增加,胶原的交联程度升高并不断老化流失,因此很有必要补充新鲜的胶原。通常来说,胶原的分子量越低越容易被人体吸收利用,因此需要开发低分子量的胶原制剂作为保健食品以及护肤品的功效成分。同时一些胶原多肽又具有抗氧化等生理活性,所以还应在低分子量的基础上积极寻求具有抗氧化活性的胶原肽以进一步增加美容保健的效果。大黄鱼是我省的主要海洋经济鱼类,在加工成干品的过程中产生了大量废弃的鱼鳞,如对这些鱼鳞加以利用制备胶原肽,不仅可以减少对环境的污染,还能为生产胶原制品提供资源。本文以大黄鱼鱼鳞为原料,通过前处理得到鱼鳞胶原蛋白,之后采用蛋白酶水解鱼鳞胶原蛋白以制备抗氧化水解物,优化其酶解条件,并对水解产物进行色谱分离纯化以获得抗氧化活性较高的胶原肽,进而对其结构进行鉴定分析。主要研究结果如下:(1)预处理中,0.4M盐酸脱钙处理时间控制在1h,0.1M NaOH脱杂蛋白的处理时间控制在12h,可使钙质和杂蛋白基本完全脱除。在酶解前使用高压处理,可使酶解更为充分,原料基本转化为酶解液。(2)Gly、Pro、Ala、Glu、Hyp、Arg是大黄鱼鱼鳞胶原蛋白主要的组成氨基酸,Phe和Tyr的含量较少。(3)分别选用胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶,在其各自最适温度和pH下,对大黄鱼鱼鳞胶原蛋白进行相同时间的酶解,以水解度、DPPH自由基清除率、还原力、亚铁螯合能力、羟基自由基清除能力、水解液相对分子量分布作为比较的指标,结果表明碱性蛋白酶水解产物的水解度和抗氧化活性均高于其它几种酶,不同蛋白酶的水解液分子量分布相差并不是很明显。(4)根据碱性蛋白酶水解的单因素实验结果,选择水解度(DH)和DPPH自由基清除率(DSA)作为响应值设计中心组合实验以优化水解鱼鳞胶原蛋白的条件。DH为响应值的最佳条件为:pH8.0,温度54.0℃,酶添加量3.0%,时间2.3h;DH为46.63%。DSA为响应值的最佳条件为:pH7.8,温度50.8℃,酶添加量2.9%,时间2.1h;DSA为14.97%。(5)DH优化后所得的酶解液经羟丙基葡聚糖凝胶过滤层析、聚苯乙烯基反相树脂层析、反相C18柱分离纯化,得到6段具有DPPH自由基清除活性的组分,其DPPH自由基清除率IC50值分别为,M1N1:168.16mg/mL;M1N2:112.36mg/mL;M1N3:55.65mg/mL;M1N4:29.43mg/mL;M2N1:72.41mg/mL;M2N2:31.62mg/mL。(6)通过基体辅助激光解吸-飞行时间质谱对各组分进行肽段的鉴定,除M1N1没有鉴定出肽段外,其余5个组分中鉴定出12种肽:M1N2得到3种肽,分别是EGRAAGPR、KDGLRGEP和GSPGEPGER;M1N3得到2种肽,分别是GLKGDRGQPR和QPGMPGAPGR;M1N4得到2种肽,分别为QRPPEPR和EKVWKYCD;M2N1得到2种肽,分别为GPSGPVGER和QGSPGTPGQVG;M2N2得到3种肽,分别是GHQGPGGM*PGER、 VGLPGLSGPVG和GDRGYEGPR。