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鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）广泛存在于自然界,由于该菌具有强大获得耐药和克隆传播的能力,因此,随着广谱抗生素的长期广泛应用和滥用,鲍曼不动杆菌耐药趋势逐渐升高,已成为目前医院感染非常重要的条件致病菌。多重耐药、泛耐药、甚至全耐药鲍曼不动杆菌菌株呈世界流行,尤其是在重症患者及免疫力低下人群。尽管世界各国都特别重视抗生素的研发,但近年来新型抗生素的研制速度显著减缓,难度日益加大,其研发速度远滞后于细菌抗药性的变异。由于缺乏有效治疗药物,导致该菌的感染致死率高,临床治疗面临巨大挑战。噬菌体是一种可以裂解杀菌的病毒,用它治疗细菌感染被称为噬菌体治疗或噬菌体疗法（bacteriophage therapy）。由于噬菌体杀菌机制与抗生素完全不同,近年来其作为天然杀灭“超级细菌”的生物抗菌剂越来越受到各国研究者的重视。与广谱抗生素相比,噬菌体杀菌具有严格的宿主特异性。也就是说,噬菌体的抗菌谱很窄,只杀灭对其敏感的宿主菌,对其他细菌无作用。其中,噬菌体对细菌的特异性识别和吸附是决定噬菌体噬菌特异性的关键环节,也是决定噬菌体治疗成败的关键因素。因此,噬菌体尾部受体结合蛋白（phage receptor-binding protein,RBP）与噬菌体宿主菌表面噬菌体受体（phage receptor）之间相互作用的研究非常重要。但在目前,人们对噬菌体尾端吸附结构,以及细菌表面噬菌体受体的研究,大多集中在大肠杆菌属的噬菌体,对不动杆菌属噬菌体的研究非常少。噬菌体ZZ1是本课题组分离和研究的一株噬菌体,这株噬菌体可感染多株泛耐药鲍曼不动杆菌临床株。电镜下ZZ1的形态与噬菌体T4非常相似,为肌尾型噬菌体,也具有6根长尾丝和6根短尾丝,对ZZ1全基因组生物信息学分析后,我们已经预测到噬菌体ZZ1的两个受体结合蛋白基因（长尾丝蛋白基因ZZ1gp37[GeneID:18114118]和短尾丝蛋白基因ZZ1gp12[GeneID:13165127]）,本课题我们将对这两种预测的受体结合蛋白基因进行克隆表达,并进一步对两种受体结合蛋白在鲍曼不动杆菌AB09V表面的受体性质进行鉴定。材料与方法1.菌株、噬菌体和质粒鲍曼不动杆菌AB09V为本实验室保存;噬菌体ZZ1为本实验室分离所得;质粒pQE80L、DH5α、BL21购自生工生物工程（上海）股份有限公司。2.噬菌体ZZ1受体结合蛋白基因ZZ1gp37和ZZ1gp12的克隆和表达针对预测的噬菌体ZZ1gp37基因和ZZ1gp12基因分别设计引物,以ZZ1基因组DNA为模板对ZZ1gp37和ZZ1gp12进行PCR扩增。对两种扩增产物以及质粒pQE80L进行双酶切。用T4连接酶将酶切后的两种扩增产物分别与质粒pQE80L连接构建受体结合蛋白的重组质粒pQE80L-ZZ1gp37和pQE80L-ZZ1gp12。将两种重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内,对阳性克隆菌株进行质粒提取,再对重组质粒进行双酶切鉴定插入片段大小以及进一步测序验证,从而鉴定插入目的基因的正确性。再将重组质粒导入表达菌株BL21中,IPTG诱导使重组BL21菌株表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析目的蛋白的表达情况。3.噬菌体ZZ1重组受体结合蛋白的纯化及鉴定用镍柱纯化两种ZZ1重组受体结合蛋白。通过Western blotting观察两种重组蛋白与噬菌体ZZ1中和抗体的作用,从而鉴定两种重组受体结合蛋白的抗原性。将鲍曼不动杆菌AB09V分别与纯化后的噬菌体ZZ1重组gp37蛋白、ZZ1重组gp12蛋白以及两种重组蛋白的混合物作用,再通过吸附干扰实验,观察三者对ZZ1吸附鲍曼不动杆菌AB09V的竞争干扰作用。4.噬菌体ZZ1受体结合蛋白受体性质的鉴定用细菌外膜蛋白提取试剂盒和细菌脂多糖提取试剂盒分别对鲍曼不动杆菌AB09V的外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）进行提取。将提取的OMP与LPS包被ELISA板;ZZ1两种重组受体结合蛋白与包被的ELISA板作用,再分别与6×his标签单抗作用、再加入酶标记的二抗和底物作用,测OD值,判断两种重组受体结合蛋白受体的性质。分别用蛋白酶K和高碘酸盐对鲍曼不动杆菌AB09V菌进行处理,以破坏细菌表面的蛋白质和LPS,测定噬菌体ZZ1对两种方法处理后的AB09V菌的吸附效率,进一步验证两种重组受体结合蛋白对提取纯化的两种受体的吸附作用,与噬菌体ZZ1吸附细菌表面受体作用的一致性。结果1.pQE80L-ZZ1gp37和pQE80L-ZZ1gp12重组质粒的酶切产物电泳后,可观察到线性化质粒和分别约3900bp和约1500bp大小的目的条带,与预测噬菌体ZZ1的两种受体结合蛋白的基因ZZ1gp37和ZZ1gp12的大小一致。对两种重组质粒的测序结果也进一步显示,目的基因与预测基因序列完全一致。SDS-PAGE结果显示ZZ1重组gp37蛋白、ZZ1重组gp12蛋白的电泳条带分别位于约140kDa和约55kDa处,与两种受体结合蛋白预测的大小140.96kb和54.26kb也一致。2.Western blotting结果显示,噬菌体ZZ1免疫血清中的中和抗体可以特异性识别SDS-PAGE电泳后的ZZ1重组gp37蛋白和ZZ1重组gp12蛋白的电泳条带。而且吸附实验结果显示,纯化后的噬菌体ZZ1重组gp37蛋白和ZZ1重组gp12蛋白以及这两种重组蛋白的混合物与鲍曼不动杆菌AB09V作用后,均能显著干扰噬菌体ZZ1对这三种预先处理的AB09V菌的吸附。3.ELISA结果显示,ZZ1重组gp37蛋白和ZZ1重组gp12蛋白均不与OMP包被板作用,其OD450值分别为0.038±0.03和0.054±0.03,与对照组OD450值0.041±0.02相比差异无统计学意义（P>0.05）。然而ZZ1重组gp37蛋白和ZZ1重组gp12蛋白都能与LPS包被板作用,OD450值分别为0.542±0.09和1.477±0.09,与对照组OD450值（0.216±0.07）相比,差异具有统计学意义（P<0.001）。而且,完整ZZ1颗粒吸附OMP和LPS分别遭破坏的鲍曼不动杆菌AB09V菌的实验也进一步验证以上结果:当AB09V菌表面的LPS遭高碘酸盐破坏后,ZZ1吸附AB09V菌的吸附率大幅度下降,与ZZ1吸附未处理的AB09V菌相比下降了75%。然而,当鲍曼不动杆菌AB09V表面的OMP被蛋白酶K破坏后,ZZ1对此AB09V菌的吸附率与ZZ1吸附未处理的AB09V菌相比并未见下降。结论1.构建了两种噬菌体ZZ1受体结合蛋白的重组基因载体pQE80L-ZZ1gp37和pQE80L-ZZ1gp12并成功表达了噬菌体ZZ1的两种重组受体结合蛋白gp37和gp12。2.噬菌体ZZ1的两种受体结合蛋白gp37和gp12在AB09V表面的受体均为LPS。