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多药物和有毒化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family,MATE)是生物中5类解毒输出转运蛋白家族之一,成员分布广泛,遍及古细菌、细菌、酵母、动物和植物。目前,研究发现的植物中MATE型转运蛋白的转运底物有烟碱、原花青素、花青素、柠檬酸盐、脱落酸等,主要功能为次生代谢物的积累、重金属转运和激素信号转导等。原花青素(proanthocyanidins,PAs),也叫缩合单宁,是植物酚类物质中普遍存在的组分之一,呈现出多样的生物和生物化学活性,并对人体健康有潜在的有益作用。荞麦(Fagopyrum esculentum)属于蓼科荞麦属植物,是一种具有很高食用价值和医疗保健作用的经济作物,也是一种极具开发潜力的功能性食品原料。荞麦有两个常用栽培种:甜荞麦和苦荞麦。世界上其他国家栽培的荞麦大部分都为甜荞,中国是世界上唯一大面积栽培苦荞的国家,面积和产量均居世界第一。苦荞由于比甜荞含有更多的黄酮类化合物而备受关注。前期荞麦种子转录组测序结果显示,MATE注释的unigene共有54条,但对这些基因的研究报道极少,只有LEI等在荞麦中发现2个MATE基因,并通过对其编码蛋白--FeMATE1和FeMATE2的功能分析,得出两者与荞麦解除Al离子胁迫相关。基于以上报道,本研究(1)采用RACE克隆技术获得2条(Fett12和Femate3)荞麦MATE基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析;(2)完成了荞麦Fett12基因的克隆、测序,及其在甜荞和苦荞不同部位和种子不同发育阶段的表达模式;(3)运用分光光度法和HPLC法测定了甜荞与苦荞不同发育阶段花和种子中的原花青素、芦丁和儿茶素含量;(4)构建FeTT12真核表达载体,研究其在烟草中的亚细胞定位。主要结果如下:提取荞麦RNA,RACE克隆,获得了2条MATE全长cDNA序列。通过ExPASy中的protparam在线分析和构建系统进化树得知,其中1条编码一个含有492个氨基酸残基的蛋白,其分子量为53.81 kD,等电点为6.75,属于原花青素MATE转运蛋白,将其命名为Fett12(GenBankAccession No.MG515589)。将FeTT12氨基酸序列与其他植物TT12的氨基酸序列进行比对和同源分析,结果表明,FeTT12与MnTT12同源性最高,为77.3%;与拟南芥TT12同源性最低,为41.5%。另一条编码一个含有516个氨基酸残基的蛋白,分子量为56.12 kD,等电点为6.52,属于柠檬酸盐MATE转运蛋白,将其与之前报道的荞麦FeMATE2蛋白和其他物种中转运柠檬酸盐的MATE蛋白进行多序列比对及同源分析,发现其与Al离子胁迫相关的荞麦MATE蛋白FeMATE2的同源性达到96.33%;与其他柠檬酸盐转运MATE蛋白的同源性也在59%以上;因此,将其命名为Femate3(GenBankAccession No.MG515590)。Fett12基因克隆、测序结果表明:该基因的编码区全长2396 bp,由8个外显子、7个内含子组成,内含子的剪切方式均符合GT-AG剪切规律。通过与拟南芥和蒺藜苜蓿tt12的基因进行比较,得到它们的内含子外显子数量一致。荧光定量-PCR结果表明:Fett12基因的表达具有明显的时空特异性,且在荞麦叶片中的表达量最高。在甜荞与苦荞种子的不同发育阶段,Fett12的表达模式亦有差异,伴随着种子不断发育成熟,Fett12基因在苦荞种子中的表达模式呈现先升高后降低的趋势,在甜荞种子中的表达模式为逐渐升高。荞麦中,原花青素、芦丁和儿茶素作为次级代谢产物,其分布具有明显的组织器官差异。对于甜荞,原花青素在花中的含量最高;对于苦荞,原花青素在发育初期的种子中含量最高;芦丁和儿茶素均是花中含量高于种子。成熟期种子中,三种化合物在苦荞中的含量均高于甜荞,且基本都是在灌浆期(21DPA)与甜荞拉开差距。其中成熟期种子中,苦荞芦丁的含量是甜荞的16倍,原花青素的含量是甜荞的3倍。在甜荞花苞、花及种子不同发育阶段,三种化合物的含量均在花中最高。烟草亚细胞定位:成功构建了荞麦FeTT12的真核表达载体,激光共聚焦观察到FeTT12定位于膜上。本研究通过分析荞麦MATE基因的克隆与表达为MATE型转运蛋白成员在荞麦中的功能研究提供基础。