孤儿核受体NR4A家族是一类入核转录因子,参与肿瘤和心血管疾病的发生和神经系统发育等。NR4A被归类为即刻早期基因,能够感知环境的变化,并迅速做出反应。除了被细胞因子、炎症因子、固醇类激素、神经递质等细胞内源因子和外源因子激活外,还对磁场、力等物理刺激起反应。NR4A3属于NR4A家族中的一员,近年来,研究人员发现NR4A3在内皮细胞、血管、髓系细胞中的单核细胞和粒细胞、神经细胞、肿瘤中具有调节作用。在体内外研究表明,Nr4a1和Nr4a3共同调节造血干细胞和不同分化细胞的分化,尤其对祖细胞和髓系细胞的发育影响很大。NR4A1和NR4A3功能部分重叠,但NR4A3的功能并不是冗余的,已有研究证明在免疫反应中,NR4A1和NR4A3发挥的作用不同。本研究前期在先天性再生障碍性贫血患者中,发现NR4A3的表达水平出现显著降低,因此推测NR4A3可能在血液疾病中发挥重要作用。本研究首先通过整胚原位杂交实验研究nr4a3在斑马鱼胚胎的时空表达,结果表明nr4a3除了在脑部神经系统的部位强表达外,24 hpf和36 hpf分别在尾部血岛和尾部造血组织出现表达,表明nr4a3可能和造血系统的发育相关。利用Crisper-Cas9基因编辑技术构造斑马鱼nr4a3突变体成功后。近一步利用整胚原位杂交实验和荧光定量PCR检测不同细胞特异性转录因子m RNA的表达水平、领联茴香胺染色和中性红染色观察细胞状况、转基因荧光斑马鱼等共同来研究造血系统的影响。初级造血原始红细胞和血管母细胞的特异性标记分子gata1和scl的表达,表明血管特化和原始红细胞没有发生变化。造血干细胞特异性标记分子cmyb和runx1研究造血干细胞的生成和迁移的影响,发现cmyb在各个时间段都没有变化,而runx1的表达下调,提示nr4a3纯合突变体可能影响斑马鱼髓系细胞的发育。通过髓系祖细胞的特异性标记分子pu.1、l-plastin探究初级造血中原始髓细胞的发育;mpo、cebp1、cebpα和lyz、mfap4.1、csf1rα探究髓系中性粒细胞和巨噬细胞在初级造血、EMP造血和次级造血的变化,结果发现髓系祖细胞和髓系祖细胞终末分化的粒细胞和巨噬细胞在nr4a3纯合突变体中都呈现出显著下调的趋势,说明nr4a3缺失对斑马鱼造血影响,从髓系祖细胞命运决定时即开始受到阻滞,这种髓系发育异常导致髓系粒细胞和巨噬细胞分化异常。nr4a3纯合突变体淋巴细胞的发育也受到了阻滞。最后发现NF-κB信号通路受到影响,NF-κB的二聚体p52和relb的水平显著上调,提示nr4a3缺失激活了炎症反应,使髓系发育受阻。综上所述,该论文对斑马鱼nr4a3的时空表达进行了研究,利用Crisper-Cas9编辑技术构造斑马鱼nr4a3纯合突变体,发现nr4a3的缺失使斑马鱼造血系统中髓系祖细胞、粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的发育受阻。在初级造血、EMP造血、次级造血这三个不同髓系细胞产生的造血波中,nr4a3的纯合突变体使三个波中髓系发育都受到损伤。其中nr4a3突变体中髓系祖细胞的发育受损,可能进一步导致粒细胞、巨噬细胞发育受损。本文详细阐述nr4a3敲除后对髓系和淋系造成的损害,为nr4a3相关的血液疾病提供了研究基础。