论文部分内容阅读
嘌呤及其代谢产物尿酸检测方法研究和应用第一部分重氮化-黄嘌呤氧化酶-HPLC测定食物中嘌呤的方法研究嘌呤（purine C5H5N4）是核酸的重要组成部分,生物体新陈代谢中的重要物质。人体内嘌呤的主要来源有体内合成、人体组织中核酸分解以及从食物中摄取。而长期高嘌呤食物如海鲜、肉类等的摄入,再加上一些诱导因素可引起嘌呤代谢异常,导致高尿酸血症及痛风等嘌呤代谢障碍性的疾病。对于这些疾病,除采用药物治疗外,还必须限制高嘌呤食物的摄入。但目前在我国食物成分表中尚无准确完整的食物中嘌呤含量的数据,有些文献报道的食物嘌呤含量数值相差较大,因此,建立准确、简便可行的食物嘌呤含量的检测方法,并对各种食物中的嘌呤含量进行准确检测,可为补充完善我国食物成分数据库提供数据,为痛风患者等嘌呤代谢障碍性疾病患者健康膳食提供指导依据,对于预防高尿酸血症和痛风病的发生,具有重要的公共卫生意义。食物中嘌呤的测定方法多为对食物水解以后使用高效液相色谱法分别测出腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤的含量然后相加算出总和。由于嘌呤类物质的最终代谢产物都是尿酸,本研究将探索出一种测定嘌呤总量的方法——先将嘌呤类物质全部转化为尿酸,通过测定尿酸的含量来计算食物中嘌呤类物质的总量,为食物中嘌呤含量的测定提供一种准确、灵敏的分析方法。方法:腺嘌呤和鸟嘌呤可与亚硝酸作用生成重氮盐,当重氮盐的酸性水溶液加热时,发生水解生成酚,利用该反应可以将腺嘌呤、鸟嘌呤脱氨后分别转化生成次黄嘌呤和黄嘌呤。次黄嘌呤和黄嘌呤进而在黄嘌呤氧化酶的作用下转化生成尿酸,利用HPLC对转化产物尿酸进行测定,通过测定尿酸的含量得到嘌呤的总量。实验中对重氮反应时试剂的用量、反应温度及时间、黄嘌呤氧化酶的用量、最适pH以及温度、时间等实验条件进行了优化,建立了一种测定嘌呤含量的新方法,并将其用于食物中嘌呤含量的测定。结果:1.实验结果表明,最佳实验条件如下:（1） HPLC测定条件:色谱柱:安捷伦XDB-C18 （4.6 mm×250 mm,5μm）;流动相:H3PO4-KH2PO4缓冲液（7.35 mmol/L , pH 3.8）;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;进样量:20μL;紫外检测波长:254 nm。（2）重氮反应时,当鸟嘌呤、腺嘌呤浓度分别为4.0 mg/L时,最佳转化条件如下:55℃恒温水浴30 min、HCl浓度0.144 mol/L、NaNO2浓度3.0 g/L;（3）黄嘌呤氧化酶最佳作用条件为:作用浓度为100 U/L、最适温度和时间为30℃恒温30 min、最适pH 7.5。2.最佳实验条件下,嘌呤总量在11.18～111.76μmol/L范围内与生成尿酸的含量线性良好,标准曲线回归方程A = 4.1885 c - 10.505,相关系数r = 0.9999,精密度RSD<3.70 %,加标回收率在101.7 %～113.4 %之间。3.用本方法对鸡心、鸡胗、鸡肾、鸡皮、鸡肺进行测定,与未经转化测得的嘌呤总量的结果进行比较,采用配对t检验,得t = - 0.190,P > 0.05 （ P = 0.858 ）,说明两种测定方法测定的结果差别没有统计学意义。结论:本研究利用重氮化-黄嘌呤氧化酶对嘌呤进行转化并使用HPLC对转化产物尿酸进行测定,通过对尿酸的测定就可以得到嘌呤的总量,该方法灵敏度高,准确度好,用该方法对食物中的嘌呤进行转化并对转化产物尿酸进行测定,结果令人满意。第二部分分光光度法测定尿酸的方法研究及其在血清中的应用长期摄入富含嘌呤类的食物再加上一些诱导因素可引起嘌呤代谢异常,从而导致嘌呤代谢的终产物尿酸在体内沉积。正常含量的尿酸作为一种内源性的抗氧化剂,对机体是有益的,可以清除氧自由基、鳌合转移金属离子、防止细胞外超氧歧化酶降解、保护血管内皮细胞使其免受损伤。但是当血液尿酸的浓度超过正常值时,尿酸盐晶体即可沉积于关节、软组织、骨骼和肾脏等处,可引发痛风症等一系列疾病,所以尿酸含量的测定对这类疾病监测、了解病情进展具有重要意义。方法:尿酸作为还原剂,在溶液pH 3.6的条件下,将铁（III）还原为铁（II）,铁（II）进一步与邻二氮菲反应生成橙红色的配合物,采用分光光度法在510 nm处进行测定,建立了分光光度法测定尿酸的方法,本文详细探讨了影响该显色反应的各种因素,并将其应用于血清中尿酸的测定。结果:1.实验结果表明,最佳实验条件如下:测定波长510 nm、平衡温度为55℃、平衡时间为30 min、醋酸缓冲溶液pH 3.6、铁（III）溶液浓度4.5 mg/L、邻二氮菲溶液浓度0.1 g/L、离心转速3000 r/min、离心时间25 min。2.在选定的最佳实验条件下,尿酸含量在0.25～7.00 mg/L范围内线性良好,标准曲线回归方程为A = 0.1316c + 0.0023,相关系数r = 0.9997,精密度RSD<3.70 %,加标回收率在84.0 %～101.0 %之间。3.本方法测定12份血样,与酶法测定结果进行比较,经正态性分析,差值d服从正态分布,采用配对t检验,得t = 0.310,P > 0.05 （P = 0.762）,说明两种测定方法测定的结果差别没有统计学意义。结论:本研究利用分光光度法对血清中尿酸的含量进行测定,该方法相对标准偏差小于3.70 % ,加标回收率在84.0 %～101.0 %之间,尿酸含量在0.25～7.00 mg/L范围内线性良好。该方法仪器简单、操作方便、易于实现,用该方法对血清中的尿酸进行测定,结果令人满意。