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目的:
(1)周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5,Cdk5)是神经系统中重要的激酶之一,与神经系统发育和神经元正常功能的维持密切相关。近年来,在脑缺血再灌注损伤研究中发现Cdk5是神经细胞凋亡过程中重要的上游因子。然而,到目前为止尚未见到国内外有更加深入的相关报道。因此进一步阐明Cdk5与脑缺血病变时神经细胞凋亡的关系,对临床寻找新的治疗靶点很有重要意义。本项研究是应用大鼠可逆性大脑中动脉栓塞模型(MCAO)研究在脑组织缺血及再灌注损伤时Cdk5与神经细胞凋亡的关系。
(2)用线栓法建立猕猴脑缺血损伤动物模型。对建立进化程度不同的、系列的脑缺血损伤动物模型进行了初步探讨与尝试,为建立脑缺血损伤模型动物体系提供科学依据。
材料和方法:
(1)线栓法制作MCAO模型。
(2)雄性SD大鼠随机分为再灌注0小时,3小时,6小时,9小时,24小时组,用异氟烷吸入性麻醉,缺血90分钟后再灌注,进行神经功能评分。通过免疫组织化学方法观察缺血侧大脑Cdk5和磷酸化Rb阳性细胞的数量和变化;TUNEL标记法检测凋亡神经元数量和变化以及用western blot检测不同再灌注时间Cdk5蛋白水平的表达。
(3)雄性猕猴随机分为6组:阳性对照组1只;造模组8只:a.单纯左侧颈内动脉栓塞2小时再灌注24小时组4只;b.左侧颈内动脉栓塞,双侧颈总动脉夹闭2小时再灌注24小时组2只;c.左侧颈内动脉栓塞,双侧颈总动脉夹闭2小时,左侧再灌注24小时组1只;d.左侧颈内动脉栓塞,双侧颈总动脉夹闭24小时组1只。造模前后通过经颅超声多普勒血流仪(TCD)测量大脑中动脉的血流变化情况;使用任务评分法对造模后动物的神经功能进行评分;取脑,切片,TTC染色,观察梗死灶。
结果:(1)各再灌注时间点,缺血侧(右侧)脑组织的Cdk5阳性细胞随着再灌注时间增加而增多,6小时Cdk5阳性细胞数量较0小时、3小时显著增加,24小时达高峰;缺血对侧的正常脑组织中没有检测到Cdk5阳性细胞。在O小时,3小时组,缺血侧、缺血对侧都没有检测到pRb阳性细胞。6小时,9小时,24小时pRb阳性细胞随着再灌注时间增加而增多,24小时达高峰;缺血对侧各组阳性细胞约为相应缺血侧的l/6至1/5。缺血侧TUNEL阳性细胞随着再灌注时间增加而增多,6小时TUNEL阳性细胞较0小时,3小时组明显增加,24小时达高峰;缺血对侧各组仅能看到很少量的阳性细胞。Western blot结果显示缺血侧Cdk5的表达随再灌注时间增加而增加,对侧对照无明显变化。
(2)在猕猴实验组中,造模前后TCD检测发现50%模型动物大脑中动脉血流减少,37.5%血流无明显变化,12.5%血流明显增加。c组的2号猕猴造模后2小时死亡。造模组d组行为学评分明显降低并出现典型的脑中风后行为学改变:嗜睡状态,右侧肢体偏瘫,Horner氏征,拒绝饮食引水;其余动物评分有所降低,但是没有明显的行为学改变。TTC染色除d组脑组织内囊、纹状体区出现发白的梗死灶,其余组染色均为阴性。
结论:
(1)大鼠局限性脑缺血再灌注损伤可以诱导Cdk5活性和数量增加,通过磷酸化各种凋亡相关底物,在调节神经细胞凋亡过程中发挥重要的作用。
(2)用线栓法可以成功复制猕猴MCAO模型,其病理生理学和行为学改变与人类极为相似。此方法对动物创伤和对实验影响较小,简单易行,如对操作者进行一定的训练,在常规情况下即可以应用。