论文部分内容阅读
食用类百合种球发育较为缓慢,在种植生产过程中,需经过较长时间将鳞片发育形成的鳞茎种球从基叶苗培育成可商品化种植的茎秆苗,在此过程中鳞茎种球的生长由小变大、淀粉含量逐渐积累,此过程也是淀粉富集的过程。从淀粉合成代谢的角度研究鳞茎籽球的发育生理、鳞茎形成及膨大发育相关的淀粉合成酶基因调控机理有助于了解关键基因的调控功能、调控鳞茎膨大发育相关的内外因素,以期建立高效的鳞茎培育技术体系对百合种植产业鳞茎籽球生产环节具有积极指导意义。在研发兰州百合（Lilium davidii var.unicolor（Hoog）Cotton）组培鳞茎发育技术中,根据百合组培苗易生丛芽苗难长鳞茎的特点,设置四个培养阶段,分别为“丛生芽增殖阶段,小鳞茎诱导发育阶段,鳞茎膨大生长阶段,膨大鳞茎分化发育主茎秆阶段”,各阶段筛选不同培养方案,以期达到技术的最优化。在百合鳞茎发育过程中应用电镜观察淀粉颗粒积累变化及对鳞茎淀粉含量、淀粉合成相关酶AGPase、GBSS与SSS酶活性进行测定。为进一步研究相关酶基因表达情况,克隆了AGP、GBSS与SSS基因序列,在鳞茎发育的四个阶段采用实时荧光定量PCR对AGP、GBSS与SSS基因的表达模式进行分析。为研究淀粉合成限速酶基因AGP在百合鳞茎膨大发育过程中对淀粉合成代谢的调控从而影响鳞茎发育的机制,选择300 bp的AGP基因保守序列为干扰片段,利用Gateway技术构建干扰AGP基因的RNAi载体并遗传转化百合组培苗进行反向下调表达研究,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株AGP基因的相对表达量变化,Western blot检测转化植株的AGPase蛋白表达情况。主要结果如下:1.丛生芽增殖阶段使用0.30.5 mg/L BA与0.03 mg/L NAA配比能满足丛生芽稳定的继代与增殖,此阶段决定芽体的增殖系数;在小鳞茎诱导发育阶段,通过增加蔗糖浓度使丛生芽增殖阶段获得的芽体苗下部（叶片底端）变态化发育形成鳞片,并从里向外形成层层鳞片,最终形成小鳞茎;鳞茎膨大生长阶段采用0.15 mg/L BA与0.15mg/L GA3配比及适当增加蔗糖浓度使形成的小鳞茎得到急速膨大生长发育,此阶段是整个培养过程中最关键的一步;膨大鳞茎分化发育主茎秆阶段是继续培养膨大鳞茎让其分化出内层鳞片的同时使其鳞茎盘生长点开始分化形成主茎秆,此阶段完成基叶苗到茎秆苗的转变。在鳞茎不同发育阶段通过电镜观察鳞茎形成发育过程,发现其鳞片基部与内部淀粉颗粒的急剧增加及鳞茎盘生长点主茎秆的分化,表明通过所构建的四阶段培养方案能有效培育出膨大的具有主茎秆分化的鳞茎籽球。2.鳞茎发育四个阶段的淀粉含量逐渐增加,分别为19.96%、32.54%、42.68%、46.52%,达到显著性差异水平;AGPase酶活在前三个阶段显著性增加,第四阶段与第三阶段保持平稳,第四阶段开始分化主茎秆,植株所获得蔗糖碳源除分配转移至鳞茎鳞片用于合成淀粉外,部分消耗用于茎秆分化的形态建成。GBSS酶活与AGPase酶活变化类似,而SSS酶活在第三阶段表现活性最低,还需进一步研究。淀粉含量的变化、淀粉合成限速酶AGPase酶活性变化与电镜观察到淀粉颗粒的积累增加及鳞茎膨大发育的变化相一致。3.将克隆获的得AGP、GBSS与SSS基因序列提交NCBI获登录号（KP751443,KP751445、KP751444）;经生物信息学分析,克隆的AGP序列918 bp,含867 bp的开放阅读框,编码289个氨基酸;其氨基酸序列为具有腺苷转移催化功能的“PLN02241”保守结构域,第8-184位氨基酸属“GlycotranfGTAtype”保守结构域,具有糖基转移催化功能,第208-289位氨基酸属“LbetaH”保守结构域,包含5个转角,具有酰基转移酶活性;整个编码区参与淀粉与糖的代谢。GBSS序列567 bp,编码189个氨基酸,第3-188位氨基酸属于“GlycosyltransferaseGTBtype”结构域,具有糖基转移功能及淀粉合成催化活性。SSS序列1257 bp,编码419个氨基酸,具有与催化α-1,4-糖苷键形成有关的“GT1GlycogensynthaseDULL1like”结构域,在第1,4,244-246,305-306,311,328,333氨基酸位形成“ADP-binding pocket”特征结构位点,在第172,348,353-354,356,388位氨基酸形成“homodimer interface”特征结构位点,有绑定催化底物的功能。对所克隆的三个基因编码蛋白结构特征分析,表明其在百合鳞茎发育生长过程中对淀粉合成代谢具有重要意义。实时荧光定量PCR结果表明随着鳞茎发育进程,三基因均显著上调表达,且在鳞茎鳞片的表达显著性高于在叶片的表达。4.成功构建原核表达载体pET28-AGPase,能诱导表达34 kDa蛋白;制备了多克隆抗体,能与百合AGPase酶蛋白特异性反应。利用Gateway BP反应将干扰序列插入入门载体pDONR221,再进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体pJawohl8-RNAi中,构建pDONR221-AGP入门克隆与pJawohl8-RNAi-AGP表达克隆,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase蛋白表达量下调的转化植株;表明选择的AGP保守序列能作为干扰片段对百合内源AGP转录的mRNA进行下调;为研究AGP基因在百合鳞茎膨大发育过程中对淀粉合成代谢的影响从而调控鳞茎发育机制提供了信息。