研究目的:SND1,又称为p100蛋白或Tudor-SN蛋白。最初研究发现其是EB病毒细胞核抗原2(Epstein-Barr virus nuclear protein2)的共活化因子。该蛋白在各物种中分布广泛,在不同生物中具有高度的保守性,参与调控细胞的多种重要生理过程。SND1蛋白具有调节基因转录和剪接加工pre-m RNA的能力,在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。但到目前为止,SND1蛋白参与上述肿瘤的发生、发展的具体机制还不清楚,有待于进一步研究。传统的利用si RNA干扰基因表达研究基因的方法不能在细胞中完全敲除SND1基因的转录翻译,导致SND1蛋白不能完全从细胞中去除,影响对其功能的研究。最新的第三代基因编辑系统CRISPR/Cas9技术利用序列特异性的向导RNA分子引导核酸内切酶Cas9对目标靶点的特异性结合与识别,并利用其活性中心对DNA双链进行切割,从而完成对基因组的修饰与编辑。但传统的CRISPR/Cas9技术也存在脱靶效应。而改良的CRISRP/Cas9基因编辑系统的Cas9蛋白可以被改造成为特异性的切口酶,只在特定的DNA位点造成单链切口,从而激活细胞内的同源重组(HR)机制,而又可以避免引起非同源末端连接(NHEJ)造成的基因突变,从而极大提高基因编辑的效率和精确性。因此我们利用最新的改良后的CRISPR/Cas9基因编辑系统可以实现在He La细胞中完全敲除SND1基因,同时又可以避免传统方法导致的严重脱靶效应。从而构建He La细胞SND1基因敲除稳定株,为后续进一步研究敲除SND1的He La细胞对5-Fu化疗药物敏感性的影响以及对细胞周期的影响奠定基础。方法:由于人的SND1基因第一个外显子区和基因编码区的重叠区域过短,不利于设计特异性的sg RNA。因此选取第二个外显子区进行sg RNA设计。利用生物信息学手段设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sg RNA,以包含CRISPR/Cas9编辑系统必需元件的PX462质粒为载体,构建出一对靶向SND1基因第二启动子的上下游序列的CRISPR/Cas9重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定序列正确后,通过转染试剂将这一对重组质粒同时转染进入He La细胞中,24h后使用嘌呤霉素进行筛选,存活下来的为阳性细胞,然后通过有限稀释培养的方法的筛选出阳性的单克隆细胞进行扩大培养。最后用Western Blot鉴定敲除SND1基因的单克隆细胞。随后,我们进一步利用免疫荧光法确认在He La细胞中完全敲除了SND1基因;利用CCK-8法进一步研究了敲除SND1基因的He La细胞对5-Fu药物敏感度的影响,利用流式细胞术研究了敲除SND1基因对He La细胞的细胞周期的影响。结果:我们通过酶切和测序的方法验证了设计的sg RNA正确插入到表达CRISPR/Cas9编辑系统的PX462质粒载体中,转染细胞后用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞,提取蛋白利用Western Blot检测发现没有SND1蛋白的表达;同时利用免疫荧光法检测也发现完全敲除了He La细胞的SND1的表达。我们利用CCK-8法检测了敲除SND1蛋白的He La细胞对5-Fu敏感性的影响,结果表明当敲除细胞内的SND1基因表达后,He La细胞对于5-Fu化疗药物敏感度增加,提示细胞内SND1可能参与肿瘤细胞化疗耐药的产生。流式细胞术检测发现敲除He La细胞的SND1基因后,处于G1期细胞比例明显增多,G2和S期细胞比例明显降低,说明He La细胞敲除SND1基因后细胞周期被抑制。结论:我们成功利用改良后的CRISPR/Cas9编辑系统构建出He La细胞SND1基因的敲除稳定株,并利用Western Blot和免疫荧光法确认敲除了SND1蛋白;利用CCK-8法进一步研究发现当敲除细胞内的SND1基因表达后,He La细胞对于5-Fu化疗药物敏感度增加,提示细胞内SND1可能参与肿瘤细胞化疗耐药的产生;进一步研究发现He La细胞敲除SND1基因后细胞周期被抑制。最终为后续进一步研究SND1的其他功能奠定了良好的基础。