论文部分内容阅读
第一部分:尿毒症血清对肠上皮细胞屏障结构及功能的影响目的:观察尿毒症患者血清对肠上皮细胞屏障结构及功能的影响,为探究尿毒症环境直接导致肠道功能障碍提供理论基础及思路。方法:分别收集尿毒症患者及健康志愿者空腹血,检测肌酐、尿素、尿酸等重要生化指标;以Caco-2细胞为研究对象,用CCK-8检测10%、20%、30%、40%健康血清及尿毒症血清在24、48、72h的时间梯度下对细胞增殖活性影响,筛选出最佳血清浓度及最适作用时间。将Caco-2细胞按空白对照组、健康组、尿毒症组分组培养,以免疫荧光法检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1分布及形态变化,以免疫印迹法检测上述蛋白的表达水平;建立Caco-2细胞单层模型,通过光学显微镜观察形态、碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性、荧光素钠检测通透性以验证单层模型是否建立成功;将Caco-2细胞单层模型分为空白对照组、健康组、尿毒症组分组培养,采用荧光素钠透过实验检测各组模型的屏障功能。结果:(1)与健康自愿者相比较,尿毒症患者血清肌酐、尿素、尿酸明显升高(P<0.01)。(2)相较同浓度血清的健康组,30%、40%尿毒症血清培养72h后能够明显抑制Caco-2细胞增殖(P<0.01),40%健康血清培养72h后的Caco-2细胞增殖活性低于30%健康组(P<0.05),故选择30%的血清浓度、72h的作用时间用于干预实验。(3)免疫荧光提示尿毒症血清处理后Caco-2细胞ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白分布异常,表达减少;免疫印迹结果显示尿毒症血清能够下调ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的水平,与空白对照组、健康组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。(4)Caco-2细胞接种21天后形成完整、致密的细胞单层模型。尿毒症血清能够明显增加Caco-2细胞单层模型荧光素钠透过率,与空白对照组及健康组相比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)尿毒症患者血清中含氮代谢物肌酐、尿素、尿酸显著增加。(2)尿毒症血清能够下调Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表达,改变蛋白的分布及形态。(3)尿毒症血清能够增加Caco-2细胞单层模型渗透性、破坏其屏障功能。第二部分:尿素联合脲酶对肠上皮细胞屏障的损害作用及可能机制目的:观察尿毒症毒素之一的尿素对肠上皮细胞屏障结构和功能的影响。模拟尿毒症患者肠道高尿素浓度及产脲酶细菌增多状态下,研究尿素联合脲酶对肠上皮细胞屏障结构和功能的影响,并探讨NF-κB/MLCK通路在其中的作用。方法:以CCK-8检测0、10、20、40mmol/L尿素对Caco-2细胞增殖活性影响,免疫印迹法检测其ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表达水平,设定24、48、72h的时间梯度。将Caco-2细胞分为空白对照组、尿素组、脲酶组、尿素+脲酶组,分别加入完全培养基、含20mmol/L尿素的培养基、含200mg/L脲酶的培养基、含20mmol/L尿素及200mg/L脲酶的培养基培养24h,通过CCK-8检测各组生长活性,以免疫荧光法检测Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1分布及形态变化,以免疫印迹法检测上述紧密连接蛋白的表达水平,同时检测NF-κB/MLCK通路相关蛋白NF-κB P65、p-NF-κB P65、IκBɑ、p-IκBɑ、MLCK、MLC、p-MLC的表达;Caco-2细胞单层模型分为空白对照组、尿素组、脲酶组、尿素+脲酶组,采用荧光素钠透过实验检测各组模型的屏障功能。结果:(1)在0-40mmol/L的浓度范围内,尿素在24h、48h、72h三个时间点皆不能抑制Caco-2细胞的增殖(P>0.05),且对肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达无明显影响(P>0.05)。(2)尿素、脲酶对Caco-2细胞增无抑制作用(P>0.05),尿素联合脲酶可抑制Caco-2细胞的增殖,相较于空白对照组、尿素组、脲酶组,差异皆有统计学意义(P<0.01)。(3)免疫荧光提示尿素联合脲酶处理后Caco-2细胞ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白分布异常,表达减少;免疫印迹结果显示尿素联合脲酶能够下调ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的水平,与空白对照组、尿素组、脲酶组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。(4)与空白对照组、尿素组、脲酶组相比较,尿素+脲酶组Caco-2单层细胞模型荧光素钠透过率明显增加(P<0.01)。(5)相较于空白对照组、尿素组、脲酶组,尿素+脲酶组p-NF-κB P65/NF-κB P65、p-IκBɑ/IκBɑ、p-MLC/MLC比值升高明显,MLCK表达增加(P<0.01)。结论:(1)尿素在0-40mmol/L的浓度范围内不能抑制Caco-2细胞增殖,对紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达无影响。(2)尿素联合脲酶能够下调Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达,改变其分布。(3)尿素联合脲酶能够增加Caco-2细胞单层模型渗透性、破坏其屏障功能。(4)尿素联合脲酶可能通过激活NF-κB/MLCK通路对Caco-2细胞对肠上皮细胞产生损害作用。