【摘 要】
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质体转基因是植物基因工程领域的一个新增长点.质体转化系统具有定点整合外源基因并使之稳定遗传、超量表达,基因产物区域化,以及环境安全性好等诸多优点,因而倍受研究人员的
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质体转基因是植物基因工程领域的一个新增长点.质体转化系统具有定点整合外源基因并使之稳定遗传、超量表达,基因产物区域化,以及环境安全性好等诸多优点,因而倍受研究人员的青睐.本研究拟将植酸酶基因转入大豆的质体中,利用质体技术的独特优点使其在质体中得到高效表达,以减少因植酸磷不能被单胃动物有效利用而带来的磷源浪费和环境污染.本研究主要进行了如下工作:利用PCR技术克隆了来源于大豆叶绿体基因组的两段DNA靶序列soy1和soy2,以此两段DNA片段为介导重组片段,以本实验室所保存的质粒pCM11(Prrn-SD-aadA-SD-man-SD-gfp-psbA3),pCM12(Prrn-SD-BADH-SD-man-RBS-gfp-psbA3)和pCM13(Prrn-SD-betB-SD-man-SD-gfp-psbA3)为出发质粒,构建了大豆叶绿体单交换表达载体:pCS1,pCS2,pCS3,pCS4,pCS5,pCS6和双交换表达载体:pCS11,pCS22.对所构建载体上的3个三顺反子表达盒在大肠杆菌中通过平板定性和Westernblotting的方法进行了功能鉴定,结果表明同一启动子(Prrn)的三个基因均能在大肠杆菌中有效的转录和表达.克隆了三个分别来源于Bacillus subtilisl68,Bacillus licheniformis和Escherichia.coli XL1-gold的植酸酶基因yod,phyL和appA,将它们均克隆到大豆叶绿体表达载体pCS1上,构建了大豆转化载体pCS1D,pCS1L和pCS1A,再次在大肠杆菌中对载体的功能进行了活性检测,结果表明均检测到了植酸酶活性(APPA酶活最高,其次为PHYL,YOD最低),并且菌体具有壮观霉素抗性和绿色荧光,三顺反子仍能有效的转录和表达.探索了大豆以叶片为外植体的再生条件,为开展大豆质体转植酸酶基因和对多基因(尤其是多顺反子)的表达研究奠定了一定的基础.
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