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急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)是因肺实质中的炎症反应，造成肺水肿，从而诱发顽固性低氧血症。炎症反应可诱导气道结构改变，造成小气道纤维化和黏液高分泌;过度分泌的黏液会破坏黏液纤毛清除系统，阻塞气道，限制气流，加重肺部炎症反应，使ARDS患者通气更加困难。临床上用于治疗ARDS的药物或治疗方案多是保证氧合并防止并发症发生，尚无确切有效的治疗药物或治疗策略，该疾病的病死率较高。因此，开发一种有效的ARDS治疗药物亟待解决。
S-烯丙基巯基半胱氨酸(S-allylmercaptocysteine，SAMC)是存在于黑蒜中的一种有机硫化物。近来，研究报道表明SAMC具有抗肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡、抗炎、抗氧化以及抑制COPD模型中黏液高分泌等多种药理活性。但SAMC水油不溶和低生物利用度的特性，使其临床应用受到极大限制。纳米晶制剂是由100-1000nm之间的药物颗粒与稳定剂一同构成的亚微胶体分散体系，其应用范围广泛，既适用于不溶于水的药物，又适用于水溶性及油溶性均较差的药物。因此，本课题拟将SAMC制备成纳米晶制剂，用来改善其溶解度和溶出速率，并对SAMC纳米晶(SAMC-NCs)制剂抗ARDS的药理活性及相关的作用机制进行探究。
本课题研究内容主要由以下三个部分组成:(1)SAMC-NCs制剂的制备与表征;(2)SAMC体外抑制黏液高分泌和抗炎作用及机制研究;(3)SAMC-NCs对ARDS小鼠的治疗作用及机制研究。
1.SAMC-NCs制剂的制备与表征:该部分主要包括HPLC方法学的建立、纳米晶制剂处方及制备工艺的筛选、纳米晶制剂学和理化性质的考察。首先，建立了用于处方筛选和制剂评价的SAMC药物分析方法学;然后对SAMC-NCs制剂处方进行了初步筛选，以普朗尼克F-127(Pluronic F-127)和壳聚糖(Chitosan，CS)为原材料合成了PF-g-CS共聚物作为稳定剂;采用高压均质法来制备SAMC-NCs，考察高压均质技术对SAMC药物性能的影响，并以粒径大小、多分散指数(PDI)为指标筛选了制备SAMC-NCs的最优工艺参数，工艺优化结果表明SAMC-NCs在1500bar的压力下循环15次，粒径相对较小，且体系稳定;SAMC-NCs制剂学主要考察内容包括外观、粒径、多分散指数、Zeta电位，评价实验结果表明SAMC-NCs外观呈透明溶液状，平均粒径、PDI和Zeta电位分别为286.90±5.69nm、0.27±0.01和-26.40±1.35mV。最后研究了纳米晶对SMAC溶解度和溶出度的影响，结果表明将SAMC制成纳米晶后显著提高了SAMC的饱和溶解度及SAMC的溶出速率。
2.SAMC体外抑制黏液高分泌和抗炎作用及机制研究:该部分研究内容包括体外模型的建立、SAMC对黏蛋白表达和体外炎症因子mRNA表达的影响以及相关信号通路调控等方面的探究。采用LPS刺激人支气管上皮细胞16HBE建立了体外细胞模型，不同浓度的SAMC与上皮细胞共培养12h后，通过WB或RT-PCR技术检测黏蛋白、炎症相关分子的mRNA及相关信号通路的改变;实验结果显示，SAMC显著减少了16HBE细胞中MUC5AC和MUC5B的表达水平，发挥其对黏液高分泌的抑制作用;抑制了促炎性分子IL-6、TNF-α、CD86和IL-12的同时促进了抗炎相关分子IL-10、CD206和TGF-β的水平，从而实现抗炎作用;实验对SAMC机理的研究证实，SAMC是一种通过抑制MAPKs和PI3K-Akt信号通路而起到抗炎、抑制黏液高分泌的化合物。
3.SAMC-NCs对ARDS小鼠的治疗作用及机制研究:该部分研究内容包括ARDS小鼠模型的建立、SAMC-NCs对小鼠肺损伤的改善作用、对气道黏液分泌及黏蛋白表达的影响、免疫调节作用及相关信号通路的探索。本实验采用高压喷雾针以无创方式向小鼠气管滴注LPS建立ARDS模型，灌胃给予SAMC-NCs(20、40 mg/kg)或阳性药NAC(500 mg/kg)，24h后处死小鼠，收集小鼠肺灌洗液及肺组织用于SAMC-NCs药效学评价及机制研究。肺组织HE染色结果显示，SAMC-NCs的治疗修复了小鼠肺部损伤及肺间隔结构，减少了炎性细胞浸润;AB-PAS和免疫组化染色结果显示，SAMC-NCs降低了黏蛋白的表达，抑制黏液高分泌;SAMC-NCs降低了肺组织匀浆中MUC5AC和MUC5B的表达，其趋势与体外实验一致。ELISA和RT-PCR实验表明，SAMC能抑制促炎相关分子IL-6、TNF-α、CD86和IL-12的分泌，促进抗炎相关分子IL-10、CD206和TGF-β的分泌，通过调节小鼠体内炎症失衡来治疗ARDS。抗ARDS的机制实验结果表明，SAMC-NCs抑制JNK/p38、Akt-mTOR-STAT3相关通路蛋白的磷酸化，从而调节炎症及黏液高分泌。这些结果表明SAMC-NCs对ARDS的治疗作用是基于调节体内炎症和缓解黏液高分泌，改善氧合状态，降低肺部感染，可能通过MAPKs和PI3K-Akt通路发挥其治疗作用。
综上所述，本课题首先合成了新型纳米晶制剂的稳定剂，采用高压均质法制备了新型SAMC-NCs，通过原辅料配方考察和最佳制备工艺参数筛选确立了SAMC-NCs的处方和最佳制备工艺，SAMC-NCs的制剂学和理化性能研究结果显示新开发的纳米晶制剂达到了初步生物和动物用研究制剂的性能要求。其次，本课题分别于体内、外评价了SAMC对黏液高分泌的抑制功能和炎症平衡的调控作用，并进一步探究了其发挥功能的作用机制;结果显示，SAMC通过下调促炎性因子和上调抗炎性因子来调节免疫平衡，进而抑制了黏液高分泌，对ARDS起到了良好的治疗作用，其作用机制是调控JNK/p38和Akt-mTOR-STAT3蛋白的磷酸化，抑制相关基因表达，来发挥抗炎和抗黏液高分泌的作用。
S-烯丙基巯基半胱氨酸(S-allylmercaptocysteine，SAMC)是存在于黑蒜中的一种有机硫化物。近来，研究报道表明SAMC具有抗肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡、抗炎、抗氧化以及抑制COPD模型中黏液高分泌等多种药理活性。但SAMC水油不溶和低生物利用度的特性，使其临床应用受到极大限制。纳米晶制剂是由100-1000nm之间的药物颗粒与稳定剂一同构成的亚微胶体分散体系，其应用范围广泛，既适用于不溶于水的药物，又适用于水溶性及油溶性均较差的药物。因此，本课题拟将SAMC制备成纳米晶制剂，用来改善其溶解度和溶出速率，并对SAMC纳米晶(SAMC-NCs)制剂抗ARDS的药理活性及相关的作用机制进行探究。
本课题研究内容主要由以下三个部分组成:(1)SAMC-NCs制剂的制备与表征;(2)SAMC体外抑制黏液高分泌和抗炎作用及机制研究;(3)SAMC-NCs对ARDS小鼠的治疗作用及机制研究。
1.SAMC-NCs制剂的制备与表征:该部分主要包括HPLC方法学的建立、纳米晶制剂处方及制备工艺的筛选、纳米晶制剂学和理化性质的考察。首先，建立了用于处方筛选和制剂评价的SAMC药物分析方法学;然后对SAMC-NCs制剂处方进行了初步筛选，以普朗尼克F-127(Pluronic F-127)和壳聚糖(Chitosan，CS)为原材料合成了PF-g-CS共聚物作为稳定剂;采用高压均质法来制备SAMC-NCs，考察高压均质技术对SAMC药物性能的影响，并以粒径大小、多分散指数(PDI)为指标筛选了制备SAMC-NCs的最优工艺参数，工艺优化结果表明SAMC-NCs在1500bar的压力下循环15次，粒径相对较小，且体系稳定;SAMC-NCs制剂学主要考察内容包括外观、粒径、多分散指数、Zeta电位，评价实验结果表明SAMC-NCs外观呈透明溶液状，平均粒径、PDI和Zeta电位分别为286.90±5.69nm、0.27±0.01和-26.40±1.35mV。最后研究了纳米晶对SMAC溶解度和溶出度的影响，结果表明将SAMC制成纳米晶后显著提高了SAMC的饱和溶解度及SAMC的溶出速率。
2.SAMC体外抑制黏液高分泌和抗炎作用及机制研究:该部分研究内容包括体外模型的建立、SAMC对黏蛋白表达和体外炎症因子mRNA表达的影响以及相关信号通路调控等方面的探究。采用LPS刺激人支气管上皮细胞16HBE建立了体外细胞模型，不同浓度的SAMC与上皮细胞共培养12h后，通过WB或RT-PCR技术检测黏蛋白、炎症相关分子的mRNA及相关信号通路的改变;实验结果显示，SAMC显著减少了16HBE细胞中MUC5AC和MUC5B的表达水平，发挥其对黏液高分泌的抑制作用;抑制了促炎性分子IL-6、TNF-α、CD86和IL-12的同时促进了抗炎相关分子IL-10、CD206和TGF-β的水平，从而实现抗炎作用;实验对SAMC机理的研究证实，SAMC是一种通过抑制MAPKs和PI3K-Akt信号通路而起到抗炎、抑制黏液高分泌的化合物。
3.SAMC-NCs对ARDS小鼠的治疗作用及机制研究:该部分研究内容包括ARDS小鼠模型的建立、SAMC-NCs对小鼠肺损伤的改善作用、对气道黏液分泌及黏蛋白表达的影响、免疫调节作用及相关信号通路的探索。本实验采用高压喷雾针以无创方式向小鼠气管滴注LPS建立ARDS模型，灌胃给予SAMC-NCs(20、40 mg/kg)或阳性药NAC(500 mg/kg)，24h后处死小鼠，收集小鼠肺灌洗液及肺组织用于SAMC-NCs药效学评价及机制研究。肺组织HE染色结果显示，SAMC-NCs的治疗修复了小鼠肺部损伤及肺间隔结构，减少了炎性细胞浸润;AB-PAS和免疫组化染色结果显示，SAMC-NCs降低了黏蛋白的表达，抑制黏液高分泌;SAMC-NCs降低了肺组织匀浆中MUC5AC和MUC5B的表达，其趋势与体外实验一致。ELISA和RT-PCR实验表明，SAMC能抑制促炎相关分子IL-6、TNF-α、CD86和IL-12的分泌，促进抗炎相关分子IL-10、CD206和TGF-β的分泌，通过调节小鼠体内炎症失衡来治疗ARDS。抗ARDS的机制实验结果表明，SAMC-NCs抑制JNK/p38、Akt-mTOR-STAT3相关通路蛋白的磷酸化，从而调节炎症及黏液高分泌。这些结果表明SAMC-NCs对ARDS的治疗作用是基于调节体内炎症和缓解黏液高分泌，改善氧合状态，降低肺部感染，可能通过MAPKs和PI3K-Akt通路发挥其治疗作用。
综上所述，本课题首先合成了新型纳米晶制剂的稳定剂，采用高压均质法制备了新型SAMC-NCs，通过原辅料配方考察和最佳制备工艺参数筛选确立了SAMC-NCs的处方和最佳制备工艺，SAMC-NCs的制剂学和理化性能研究结果显示新开发的纳米晶制剂达到了初步生物和动物用研究制剂的性能要求。其次，本课题分别于体内、外评价了SAMC对黏液高分泌的抑制功能和炎症平衡的调控作用，并进一步探究了其发挥功能的作用机制;结果显示，SAMC通过下调促炎性因子和上调抗炎性因子来调节免疫平衡，进而抑制了黏液高分泌，对ARDS起到了良好的治疗作用，其作用机制是调控JNK/p38和Akt-mTOR-STAT3蛋白的磷酸化，抑制相关基因表达，来发挥抗炎和抗黏液高分泌的作用。