【摘 要】
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目的：在细胞水平探讨GST标签的人纤溶酶原Kringle5基因工程蛋白(GST-K5m)抗血管增生的作用。方法：利用primer premier5.0引物设计软件,PCR法得到K5m基因,再利用基因工程技术,将
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目的：在细胞水平探讨GST标签的人纤溶酶原Kringle5基因工程蛋白(GST-K5m)抗血管增生的作用。方法：利用primer premier5.0引物设计软件,PCR法得到K5m基因,再利用基因工程技术,将目的基因克隆至pGEX-4T-3的BamHI和Xhol位点。再将该pGEX-4T-3/K5m重组质粒转染到BL21(DE3)宿主菌中,表达出可溶性重组蛋白。采用GST树脂亲和纯化融合蛋白,对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳和Vestern-blot分析鉴定,结果显示得到分子量约为37kDa的融合蛋白。为了验证GST-K5m融合蛋白是否具有生物学活性,用不同浓度的(25-1280nmol/L) GST-K5m融合蛋白分别处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、肝癌细胞(Bel7402)(?)口正常肝细胞(NLC), MTT法检测各组的细胞抑制率,PI单染法和hoechst33258染色法标记各组凋亡细胞。用不同浓度的GST-K5m融合蛋白及His6-K5重组蛋白处理HUVECs,接着用transwell实验检测GST-K5m融合蛋白对人脐静脉内皮细胞迁移功能的影响。结果：GST-K5m融合蛋白可抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖,呈浓度依赖关系,但是对肝癌细胞和正常肝细胞存活率无明显影响;GST-K5m融合蛋白对正常肝细胞(NLC)和肝癌细胞(Bel7402)无明显凋亡诱导作用,但具有诱导内皮细胞凋亡的作用；GST-K5m融合蛋白及His6-K5重组蛋白均抑制HUVEC的迁移。结论：1、构建了pGEX-4T-3/K5m重组质粒,并获得带GST标签的GST-K5m融合蛋白。2、体外实验证实,GST-K5m重组蛋白可特异性的抑制血管内皮细胞增殖和迁移,并诱导内皮细胞的凋亡,且对肝癌细胞和正常肝细胞无明显的效应。
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