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近年来,有研究提出“阿尔兹海默病(AD)是3型糖尿病”的假说。该假说指出在AD病人的脑部胰岛素相关细胞生存信号转导通路受到损害,胰岛素或者胰岛素样生长因子1信号通路发生异常。临床研究证明,对AD病人和具有轻度认知功能障碍的病人进行鼻内胰岛素治疗可起到一定的治疗作用。3β-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)是一种具有抗神经细胞凋亡作用及胆固醇合成活性的多功能蛋白酶。我们先前的研究证明DHCR24能够通过促进胆固醇的生物合成、维持细胞窖的结构以及insulin-Akt-Bad信号通路来保护小鼠胚胎纤维母细胞免于由血清缺失引起的细胞凋亡,而且能通过清除活性氧抑制应激信号通路等机制保护神经细胞。为了探究DHCR24通过保护神经细胞从而对AD的可能的治疗效果,本课题利用已构建好的能实现神经特异性表达DHCR24的重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24,在细胞水平初步研究了神经细胞内上调DHCR24表达对神经细胞的保护效果,并研究其发挥作用的具体机制,为将DHCR24开发为AD治疗的新的基因治疗靶点奠定了坚实的基础。首先,我们主要对小鼠神经母细胞瘤细胞株N2A细胞,大鼠胚胎大脑皮质原代培养细胞转染以及大鼠侧脑室注射重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24,验证其神经特异性上调表达DHCR24的效果。Western Blotting的结果显示重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24的处理能显著性上调N2A细胞,大鼠胚胎大脑皮质细胞以及大鼠大脑海马回区域的DHCR24蛋白的表达。然后,我们研究了重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24对各种刺激下神经细胞的保护作用。研究结果证明Ad-hSYN1-DHCR24能保护N2A细胞、大鼠胚胎大脑皮质神经细胞免于由β-淀粉样蛋白(Aβ)聚积、氧化应激以及内质网应激等各种刺激诱导的细胞凋亡,发挥神经保护作用。我们先前的研究表明神经细胞内胆固醇水平的降低会使细胞窖结构遭到破坏,造成细胞凋亡。因此我们着重探讨了Ad-hSYN1-DHCR24在神经细胞通过作用于细胞窖和胰岛素信号通路而发挥神经细胞保护作用的可能性。重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24能够显著改善胰岛素生长因子IGF-1对N2A细胞的神经保护作用。Western Blotting的结果证明腺病毒的这种保护作用是通过增强IGF-IRS-Akt细胞生存信号转导通路的活化而实现的。细胞内胆固醇含量测定结果显示,腺病毒介导的DHCR24过表达能显著提高N2A细胞内胆固醇含量。而双重免疫荧光染色结果证明DHCR24过表达增强了IGF-1受体在细胞膜上微结构域细胞窖里的定位。而大鼠侧脑室注射的组织免疫荧光化学染色结果也首次证明在大鼠海马回区域IGF-1受体很好地定位于细胞窖中。综上,驱动神经特异性DHCR24表达的重组腺病毒Ad-hSYN1-DHCR24可以在细胞及整体动物水平上调DHCR24表达,并且在细胞水平上通过合成胆固醇,提高细胞内胆固醇水平,维持细胞窖结构,增强IGF-IRS-Akt信号通路发挥神经细胞保护作用。综上所述,本论文对Ad-hSYN1-DHCR24重组腺病毒的神经细胞保护作用进行了初步的药效学研究,证明重组腺病毒驱动的DHCR24过表达能够保护各种条件刺激下的神经细胞,特别是能通过增强细胞窖的功能而改善IGF-1的神经细胞保护作用。本研究为将DHCR24开发为AD基因治疗的新靶点提供了重要的理论依据,并且为将Ad-hSYN1-DHCR24重组腺病毒开发为新的AD基因疗法药物而奠定了坚实的基础。