1 背景慢性心力衰竭是各种心脏病的终末和严重阶段,是当今世界常见的慢性心血管疾病,有资料显示心衰住院患者5年死亡率达到50%,对人类社会造成了极大的影响。人参是常见的补气药,可用于调整血压、恢复心脏功能及身体虚弱等。课题组前期运用整合药理学以及分子对接等技术,发现人参补气功效可能与干预人体能量代谢相关途径有关,而慢性心衰也与人体能量代谢过程有着密切的关系。基于以上思考,本研究从人参治疗慢性心衰的药效学评价以及分子机制入手进行研究,为人参的临床应用以及慢性心衰的分子机制研究提供了一定的理论基础和依据。2研究内容及结果2.1人参治疗慢性心衰药效学评价本部分内容使用了冠状动脉左前降支结扎心梗致心衰模型进行药效学评价。根据该模型的特点,冠状动脉左前降支结扎致心梗后发展为慢性心衰时间大约为4周,因此造模之后,对大鼠正常喂养4周,之后采用Vevo2100超高分辨率小动物彩色超声多普勒成像系统对大鼠心功能进行检测,依据大鼠左心室射血分数(EF%)选取成模大鼠进行后续实验。成模后对大鼠随机进行分组,分为人参组,阳性药(缬沙坦)组,假手术组,模型组以及生理盐水组共5组。每给药2周进行一次超声检测,主要考查左心室射血分数(EF%),左心室短轴缩短率(FS%),左心室后壁舒张末期厚度(LVPWd),左心室后壁收缩末期厚度(LVPWs),左心室舒张末期内径(LVIDd),左心室收缩末期内径(LVIDs),收缩期室间隔厚度(IVSs)和舒张期室间隔厚度(IVSd)等指标的变化来初步评价药效,随后又采用心室压力容积测定系统对大鼠的心功能进行进一步检测,之后采用酶联免疫方法(ELISA)对衡量心力衰竭常用指标脑钠肽(BNP)进行了检测,并结合病理切片HE的变化情况来评价药效。直至给药6周后,对大鼠进行取材。大鼠造模后4周,超声检测显示大鼠EF%显著下降。将动物随机分为模型组,人参组,缬沙坦组,假手术组以及生理盐水组。每给药2周进行一次超声检测,到给药6周时进行取材。人参组大鼠以及缬沙坦组大鼠左心室射血分数(EF%),左心室短轴缩短率(FS%),左心室后壁舒张末期厚度(LVPWd),左心室后壁收缩末期厚度(LVPWs),收缩期室间隔厚度(IVSs)和舒张期室间隔厚度(IVSd)与模型组大鼠相比明显升高;人参组大鼠以及缬沙坦组大鼠左心室舒张末期内径(LVIDd),左心室收缩末期内径(LVIDs)与模型组大鼠相比明显降低;心室压力-容量检测显示在经过给药之后,大鼠的左心室射血分数(EF%)显著提高;对于衡量心力衰竭的常用指标脑钠肽(BNP),给药之后呈一定的降低趋势;病理切片HE结果显示人参组以及缬沙坦组大鼠相比模型组大鼠心肌组织以及心功能均得到提升。提示人参可以在一定程度上保护心脏,缓解心衰。2.2人参治疗慢性心衰分子机制研究本部分根据前期实验及文献调研结果,选取人参组、模型组与假手术组样本中具有代表性的左心室样本对mRNA进行RNA-seq二代测序即转录组测序。筛选了 3组之间的差异表达基因,并对差异表达基因进行通路富集分析,并且对相关差异基因在左心室样本中的表达情况进行检测来初步探索人参治疗慢性心衰可能作用机制。本部分运用转录组学技术对造模后以及给药后差异表达基因进行了分析。根据差异基因筛选标准即 false discovery rate FDR<0.05,|Fold change|>1.5 筛选出差异基因后,对差异基因进行KEGG通路富集分析。给与人参提取液后,可以看到 Ndufa4、Atp5pd、Atp5mc3、Atp5fla、Sdhb、Cox10 等参与氧化磷酸化过程的基因;Echs1、Acs16、Acsl1、Acox1等参与脂肪酸代谢的基因;Acad1、Acs16、Acsl1、Acox1等参与PPAR signaling pathway的基因在给药之后出现一定程度的回调,说明人参可能通过干预能量代谢相关途径对心衰发挥干预作用。之后对筛选出的人参给药之后上调的400个差异基因所富集出的相关通路进行深入地分析,得到给药后上调基因共富集出30条KEGG通路。包括:三羧酸循环,氧化磷酸化,丙酸酯代谢,丙酮酸代谢,脂肪酸生物合成,碳代谢,脂肪酸降解,脂肪酸代谢,赖氨酸降解以及PPAR信号通路等通路,而人参给药之后下调的327个差异基因所富集出的相关通路进行深入地分析,得到给药后下调基因共富集出23条KEGG通路。包括:细胞因子-细胞因子受体,Ras信号通路,NF-κB信号通路,金黄色葡萄球菌感染,趋化因子信号通路等。本研究结果在一定程度说明,人参可以通过增强体内能量代谢相关过程,同时下调部分炎症相关因子对心衰发挥作用。对差异基因PPAR α及其下游因子Acox和Acsl1的检测结果也进一步说明人参可以增强体内能量代谢相关过程。本研究结果在一定程度说明,人参可能通过增强体内能量代谢相关过程对心衰发挥作用。2.3人参干预慢性心衰机制体外研究本部分根据转录组结果以及文献调研结果,对富集出的关键通路及通路之间的相互关系进行分析,结合文献调研结果筛选出关键转录因子进行体外实验研究。在人参中,已有多种皂苷被证明可以对慢性心衰发挥治疗作用,为了进一步确认人参中治疗慢性心衰的是否为人参皂苷部分,且人参醇提物中的主要成分也是人参皂苷,因此我们对人参提取液中的总皂苷进行提取。选用心肌H9c2细胞为研究对象,分别给与人参提取液、人参提取液中萃取得到的人参总皂苷之后,观察关键转录因子的变化情况。对人参干预心衰的作用,在动物实验基础上进一步进行体外实验研究。根据转录组结果以及文献调研结果,人参可能通过影响能量代谢过程发挥对心衰的治疗作用。富集到的能量代谢通路中,脂代谢通路为一些能量代谢通路的上游,而PPARα为脂代谢中PPAR通路的关键因子,因此我们选择了 PPARα作为关键转录因子进行研究,在细胞中加入人参提取液,人参总皂苷之后,检测PPARα的表达情况。结果表明,正常细胞加药给与人参提取液,人参总皂苷之后,随着给药时间的增加,PPAR α基因表达水平有不同程度升高。3结论本研究证明,人参可在一定程度上改善冠状动脉左前降支结扎心梗致慢性心衰的疾病以及发展过程,具有一定程度的改善心功能作用。运用转录组学技术,对3组之间差异表达的基因进行分析得到,人参给药后可能对PPAR信号通路,三羧酸循环,脂肪酸代谢起到一定的调控作用,在一定程度说明人参发挥对心衰的治疗作用可能的机制为干预人体的能量代谢相关过程来实现。结合转录组学以及文献调研结果,选取能量代谢通路关键转录因子PPARα进行细胞水平研究发现,给与正常培养H9c2心肌细胞人参提取液,人参总皂苷之后,可以使PPAR α基因表达情况出现一定程度上调,进一步证明,人参干预心衰可能与能量代谢过程相关,并且可能是通过干预PPAR通路实现对心衰的治疗作用。