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甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤,近年来甲状腺癌的发病率快速上升,已被列入恶性肿瘤的前10位。根据2016年美国国家癌症署数据显示,全世界新发的甲状腺癌以平均每年大于5%的速度递增,其中增长最快的是甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)。我国 2000-2011 年癌症相关数据显示:在 2000年至2003年间的每年发病增长率是4.9%,而2003年至2011年的每年发病增长率显著上升至20.1%。虽然绝大多数PTC预后优异,10年生存率可达90%以上,但约有50%病人在发现时已经存在颈部淋巴结转移,约有10-20%的病例会出现反复发作及远处转移,一旦发生远处转移,10年生存率降至40%左右。目前,临床上对于PTC的主要治疗方式是手术切除,放化疗基本无效。但是,近几年来学术界对于PTC是否需要手术开始出现争议,部分专家认为PTC恶性程度低,进展缓慢,对于直径小于1cm的甲状腺微小乳头状癌(Papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)可暂时予以随访观察。而另一部分支持手术的专家则认为微小癌不一定等于低危癌,在临床中很多微小癌患者的进展速度非常快,在疾病早期就出现局部浸润或远处转移,故而在目前缺乏有效鉴别手段的情况下,PTC的早诊早治还是十分有必要的。但是,目前导致PTC发病和进展的详细分子机制仍未被完全阐明。因此研究高危型PTC的重要分子事件,筛选用于表征高危型PTC恶性演进及转移相关的分子标志物,进而早期从众多PTC患者中鉴别出高危型患者,实现精准有效的早期诊断和预后预测,对患者进行分层治疗,具有重要的理论意义和临床应用价值。lncRNA是一类长度超过200bp的非编码RNA,越来越多的证据显示lncRNA在基因的转录、表观修饰及转录后调节都发挥着重要的作用。已经有研究报道lncRNA在胃癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌等多种实体肿瘤的进展中发挥着重要作用。lncRNA可能通过调节染色体结构或是调节下游基因的表达来发挥癌基因或抑癌基因的作用。因此,lncRNAs有希望成为今后肿瘤诊治过程中的重要分子标志物和潜在靶点。我们以甲状腺乳头状癌IHH4细胞为母株,通过Transwell小室筛选实验及细胞培养技术,经过15代筛选培养,成功筛选出具有高侵袭转移倾向的甲状腺乳头状癌细胞亚株IHH4-M。并通过一系列体内和体外实验证实IHH4-M具有较高的侵袭转移能力。同时,通过lncRNA基因芯片筛选差异表达lncRNA和mRNA,构建了转移相关lncRNA差异表达谱和mRNA差异表达谱,筛选转移相关的候选lncRNA;并通过对60例甲状腺乳头状癌患者的新鲜肿瘤组织和癌旁对照组织进行RT-PCR实验检测发现:lncRNAAP000472.2与甲状腺乳头状癌的包膜侵犯及淋巴结转移密切相关,而与患者性别、年龄及肿瘤大小等无相关性,故而确定了 lncRNA AP000472.2作为研究对象。为了进一步证实lncRNA AP000472.2在甲状腺乳头状癌侵袭转移中的作用并探究其相关分子机制,我们构建了 lncRNA AP000472.2过表达慢病毒和siRNA慢病毒,通过过表达和敲除lncRNA AP000472.2相关实验研究发现:上调lncRNA AP000472.2表达能促进甲状腺乳头状癌IHH4细胞上皮细胞间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程,显著增加 IHH4 细胞的增殖和侵袭转移能力,相反,敲除lncRNAAP000472.2表达能阻断甲状腺乳头状癌IHH4-M细胞EMT过程,并降低IHH4细胞的增殖和侵袭转移能力。这说明:lncRNA AP000472.2确实能够促进IHH4细胞EMT过程,并增加IHH4细胞的增殖和侵袭转移能力,但其中相关的分子机制仍不明确。为了解决这一问题,我们根据lncRNA芯片结果构建了 lncRNA-mRNA共表达网络,同时利用顺式(cis)及反式(trans)预测法预测lncRNAAP000472.2下游调控基因,并通过RT-PCR、WB等方法验证,最终选定DEAR1作为候选下游调控基因。为了进一步验证DEAR1是否为lncRNA AP000472.2下游调控基因,我们在lncRNAAP000472.2 敲除 IHH4-M 细胞和 lncRNAAP000472.2 过表达 IHH4-C 细胞的基础上,进一步设计了 DEAR1过表达慢病毒和RNAi干扰慢病毒。实验发现:在IHH4-M细胞中敲除lncRNA AP000472.2后,DEAR1蛋白表达量明显上调,SMAD3蛋白表达量下调,TGF-β信号通路受到抑制,IHH4-M细胞的侵袭和转移能力明显下降,EMT相关标志物N-cadherin、twist、MMP9等表达量下调,而当继续敲除DEAR1表达后,可见SMAD3蛋白表达量明显上调,TGF-β信号通路被激活,IHH4-M细胞的侵袭和转移能力部分恢复,且N-cadherin、twist、MMP9等表达量部分上调;反之,在IHH4-C细胞中导入lncRNAAP000472.2后,DEAR1蛋白表达量明显下调,SMAD3蛋白表达量上调,TGF-β信号通路被激活,IHH4-C细胞的侵袭和转移能力明显增强,EMT相关标志物N-cadherin、twist、MMP9等表达量上调,而当继续过表达DEAR1表达后,可见SMAD3蛋白表达量明显下调,TGF-β信号通路受到抑制,IHH4-C细胞的侵袭和转移能力部分下调,且N-cadherin、twist、MMP9等表达量部分下调。这提示:在甲状腺乳头状癌IHH4-M细胞中,lncRNAAP000472.2可以通过下调DEAR1蛋白表达,进而激活TGFβ信号通路及EMT过程,从而促进肿瘤的侵袭转移。本论文从构建甲状腺乳头状癌高转移细胞亚株开始,通过基因芯片筛选甲状腺乳头状癌转移相关的lncRNA及mRNA,并通过实验证实lncRNA AP000472.2在甲状腺乳头状癌侵袭转移中的作用及相关机制。研究结果不仅加深了对甲状腺乳头状癌新的侵袭转移机制的认识,还有希望为甲状腺乳头状癌高危患者的早期诊治提供新的预警标记物或药物干预靶点,为甲状腺癌患者分层诊断及精准治疗奠定理论基础与实验依据。