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去泛素化酶CYLD通过水解特定靶蛋白中高度特异性的泛素-蛋白复合体,从而在包括肿瘤的抑制、免疫、炎症反应以及参与Akt信号通路等不同的生理过程中发挥着重要作用。从基因图库中我们得知Cyld基因在纹状体的表达量最高,有趣的是,关于Cyld基因对纹状体功能影响的研究却鲜有报道。Akt能调控神经细胞的生存、凋亡,有着显著地影响,而纹状体中90%以上的神经元都是GABA能神经元。本实验试图通过Akt为桥梁,以纹状体为靶点,通过分子生物学手段和全细胞膜片记录的电生理手段,探索敲除Cyld基因后对小鼠神经系统功能的影响。主要实验结果如下: 1探究敲除Cyld基因的小鼠纹状体中Akt蛋白以及发挥主要功能的磷酸化Akt蛋白(pAkt)是否存在表达量上的改变。通过免疫蛋白印迹(Western Blot)和免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)的方法,对野生型小鼠WT和基因敲除型小鼠Cyld-/-纹状体做组织提取、蛋白定量检测和组织切片染色,发现在基因敲除型小鼠Cyld-/-中,Akt的表达量没有显著性的变化,但是发挥功能的pAkt表达量显著性增多,说明敲除Cyld基因通过升高pAkt表达从而参与到pAkt调控的信号通路中来。 2 GABA能神经元占到纹状体中神经元总数90%以上,由于GABA能神经元分泌的神经递质必须要通过突触后膜上的GABA受体才能发挥作用,因此,受体是影响纹状体发挥正常生理功能的一个关键环节。为一步探究敲除Cyld基因是否能够对纹状体神经元有功能上产生的影响,我们选取纹状体中的GABAA受体蛋白为目标,来探究CYLD的缺失,是否会对纹状体中神经元的功能有所影响。同样对WT和Cyld-/-小鼠进行Western Blot和IHC对其纹状体进行蛋白定量检测和组织学切片染色观察,我们发现,在Cyld-/-小鼠的纹状体中GABAAR蛋白的表达与WT小鼠相比有着显著的上升。 3 GABAA受体介导抑制性突触的快速和慢速突触传递。受体蛋白表达的变化,对调节纹状体突触传递效能有着重要的影响。在对纹状体突触效能研究之前,我们想先探究CYLD对神经元电生理内在特性有没有影响。对野生型和敲除型胎鼠纹状体神经元做急性离体细胞培养,并对其进行全细胞膜片钳记录。给予WT和Cyld-/-新生小鼠纹状体神经元注入0-100 pA,持续300 ms,步阶为20 pA的电流刺激,发现两者F-I曲线斜率并没明显差异。给WT和Cyld-/-新生小鼠纹状体神经元注入-100-0 pA,持续300 ms,步阶为20 pA的超级化电流脉冲刺激,WT纹状体神经元膜输入阻抗为623.22±11.45 MΩ,Cyld-/-纹状体神经元膜输入阻抗为628.21±11.24 MΩ,两者膜输入阻抗并没明显差异。WT和Cyld-/-新生小鼠纹状体神经元动作电位的半峰宽和复极化时程有显著差异。说明基因的缺失很有可能影响了神经元细胞膜上的某些离子通道。 综上所述,敲除Cyld后,影响了小鼠纹状体神经元细胞内信号通路蛋白Akt的活化性质,使pAkt显著增多,影响了Akt参与的控制细胞功能的信号通路。同时,敲除Cyld后纹状体神经元上的GABAA受体蛋白表达量显著升高,并有可能通过此途径来影响纹状体神经元的电生理功能。