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目的:根据SEPT9基因序列设计并合成相应SEPT9-siRNA,探讨SEPT9-siRNA对人肝癌细胞系MHCC97-H细胞生长特异性抑制作用及其凋亡的影响,进一步揭示SEPT9基因在肝癌发生发展过程中的作用。 方法:根据SEPT9基因核苷酸序列设计4对针对SEPT9基因的靶序列,由生物公司构建4个针对SEPT9基因的siRNA,同时构建不针对任何基因的带有绿色荧光蛋白基因的siRNA,预实验筛选出一个有效siRNA,其靶序列为GGCAGCCCATCATGAAGTTCA。培养MHCC97-H细胞,待细胞生长状态良好并达到指数生长期时,于转染前一日接种于6孔板(CCK-8法检测MHCC97-H细胞生长抑制情况用96孔板接种),设实验组、阴性对照组和空白组。以每孔脂质体LipofectamineTM20007.5ug,重组siRNA3ug配成转染复合物,加入各孔MHCC97-H细胞中进行转染(空白组不加任何试剂)。转染后48h荧光显微镜下观察绿色荧光细胞所占比例,判断转染效率。①RT-PCR法检测SEPT9mRNA的表达抑制情况:转染后48h,提取各组细胞总RNA,逆转录合成cDNA,并经PCR反应扩增,琼脂糖凝胶电泳,最后凝胶成像分析系统吸光度扫描观察结果。②用westernblot法检测SEPT9蛋白质的表达抑制情况:转染后48h,提取各组细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,以GAPDH蛋白为内对照进行SDS-PAGE电泳,半干法转膜,一抗、二抗杂交孵育,化学发光液显影并用紫外凝胶成像分析系统自动曝光,结果用凝胶成像仪扫描QuantityOne4.4.0软件分析,检测各组SEPT9蛋白的相对表达量。③以0h、24h、48h、72h为时间点,用CCK-8法检测SEPT9-siRNA对细胞生长抑制的影响。④转染后48h用流式细胞技术AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测各组MHCC97-H细胞凋亡率。⑤细胞划痕实验检测各组MHCC97-H细胞0h、24h、48h、72h的迁移率。 结果:①转染后48h荧光显微镜下观察,根据发绿色荧光的MHCC97-H细胞所占比率判断LipofectamineTM2000转染MHCC97-H细胞的转染效率达75％以上。②RT-PCR法检测结果显示:实验组SEPT9条带亮度明显弱于两对照组,灰度扫描半定量结果显示实验组MHCC97-H细胞中SEPT9mRNA表达水平显著底于两对照组。③免疫印迹分析显示:各组内对照GAPDH蛋白条带的亮度相似,而septin-9蛋白条带亮度实验组明显弱于其它两组。QuantityOne4.4.0软件分析结果显示,实验组、阴性对照组、空白组septin-9蛋白的相对表达量分别为0.448±0.044、1.844±0.047、1.876±0.036。经SNK-q检验方差分析,实验组septin-9蛋白相对表达量分别与空白组及阴性对照组相比,均下降76%左右,差异有统计学意义(P<0.01),而其它两组之间相比,无显著性差异(P>0.05)。④CCK-8法检测结果显示;在0h~72h范围内,实验组与空白组、阴性对照组的OD值相比较,差异具有显著性(P<0.01),其它两组之间相比,无显著性差异(P>0.05);表明SEPT9-siRNA对MHCC97-H细胞生长有明显抑制作用。⑤流式细胞仪检测显示:空白对照组、阴性对照组、实验组转染72h细胞凋亡率分别为(28.28±3.45)%、(5.65±1.56)%、(5.33±1.81)%,经q检验方差分析,实验组转染后12h细胞凋亡率即开始升高(P﹤0.01),随后逐渐升高,72h凋亡率达到最高,而阴性对照组较空白对照组无显著差异(P﹥0.05)。⑥细胞划痕实验结果分析,与空白对照组和阴性对照组相比,实验组划痕宽度明显缩小,差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组和阴性对照组两者间划痕宽度差异无统计学意义(P>0.05)。 结论:1.针对SEPT9基因的RNAi靶序列设计有效;合成的siRNA通过脂质体介导的方法能高效转染MHCC97-H细胞,并有效抑制MHCC97-H细胞中相应基因的表达。2.靶向SEPT9的siRNA能显著抑制MHCC97-H细胞的生长和增殖,促进细胞凋亡。3.靶向SEPT9的siRNA能有效抑制MHCC97-H细胞迁移。