研究背景抑郁症是一种常见的精神、心理疾病,严重影响患者的正常生活和身心健康,也给患者家庭带来沉重负担。当前全球抑郁症患者达3.5亿,世界卫生组织(WHO)预计到2020年抑郁症将跃居世界疾病负担的第二位。在过去的几十年里,人们对抑郁症相关的分子、细胞和信号通路做了很多的探索,但是引起抑郁症发病的机制尚未明确,同时有效的抗抑郁治疗方法发展缓慢,临床治疗效果并不理想,因此抑郁症的探究任重道远。现实生活中很多人面临着来自工作、学习和家庭等各方面的压力,使人经常处于一种应激的状态。长期的不良应激可能会引起情感、认知和生理方面的障碍,提高机体患抑郁症的风险,因此慢性应激是引起抑郁症发病的重要因素。有关应激性抑郁症的机制人们也做了很多的探索,并发现神经递质,信号通路,锌缺乏和细胞因子等方面的变化与抑郁症关系密切,其中免疫功能紊乱可能是抑郁症发病的重要诱因。临床研究发现,与正常人群比,抑郁症患者体内的炎性细胞因子显著升高。同时发现给予抗抑郁药可以改善机体的炎症水平,如选择性血清素再吸收抑制剂(SSRIs)能明显抑制炎性因子的作用,使炎性细胞因子释放减少,如TNF-α、IFNγ、IL-1β等。但是应激性抑郁症为什么常伴随着机体炎症水平升高,以及免疫应答引起的功能异常在抑郁症的发病过程中的作用机制仍是不明确的,还有待进一步研究。在应激诱发抑郁症的过程中,小胶质细胞被激活是关键环节,在众多研究中抑郁症也被认为是一种小胶质细胞疾病。神经胶质细胞对于维持正常的脑功能有关键作用,而小胶质细胞与动物行为又密切相关,因此小胶质细胞是研究神经炎症,神经退行性疾病及抑郁症的重要靶点。但是应激激活小胶质细胞炎症反应的机制是不明确的,特别是在应激诱发抑郁症的过程,这也是我们本课题关注的重点。基于以往的研究,我们推测应激引起的炎症可能是一种非感染性的代谢性炎症反应,代谢紊乱引起的代谢性炎症的发生,可能涉及调节代谢的关键蛋白SIRT1。SIRT1的编码基因位于染色体10q22.1,依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)发挥脱乙酰化作用,是机体关键的“代谢感受器”。SIRT1通过与多种参与应激反应的转录子相互作用影响细胞的分化、细胞凋亡、肿瘤的发生以及机体代谢过程。同时,SIRT1能够通过抑制Akt/GSK3,NF-κB等多条细胞信号通路发挥抗炎作用,有证据证明SIRT1参与调节神经元的分化,可以有效预防神经退行性病变,具有神经保护作用。Taro Kishi等在日本人群中的调查也发现SIRT1基因表达与重度抑郁症(major depressive disorder,MDD)可能相关的现象,这提示SIRT1功能下降可能是抑郁症发病的重要机制,这也为我们本课题的研究奠定了基础。综上所述,炎症反应可能是抑郁发病的重要影响因素,但炎症反应的变化机制并不明确。因此,探索SIRT1与抑郁症的关系,炎症和抑郁症的关系,以及SIRT1如何调控应激性炎症反应,对于抑郁症的研究进展有重要意义。实验目的本研究通过慢性不可预知应激建立BABL/c小鼠抑郁模型,并利用SIRT1的激活剂白藜芦醇干预抑郁小鼠,观察应激小鼠脑组织中SIRT1表达与抑郁样行为之间的关系,并初步检测SIRT1调控的信号通路的变化。最后,在细胞水平进一步验证SIRT1对BV2小胶质细胞炎症反应的调控及相关机制,希望能为抑郁症的机制研究及临床治疗提供一定的实验依据。实验方法1、建立小鼠抑郁模型雄性BABL/c小鼠(购自上海西普尔必凯公司),体重(20±2)g。根据体重随机分为5组,分别为对照组(Con)、应激35天组(Stress)、应激加白藜芦醇给药组(Stress+Res)、白藜芦醇给药组(Res)、DMSO溶剂对照组(DMSO)。在糖水适应两周后,每天在不固定的时间采用一种应激方法干预小鼠,共有7种随机排序的应激方法,分别是束缚应激2h、垫料打湿24h、摇晃10min、鼠笼倾斜24h左右、饮食剥夺24h、45℃烘箱热应激5min、4℃水游泳冷应激5min。每隔七天晚上进行一次糖水偏爱实验,应激5周后测定小鼠的行为学指标(自发活动实验和悬尾实验)。行为学实验结束后称重,小鼠处死后采集血清、海马、前额皮质等组织标本备用,取附睾脂肪并称重。2、小鼠行为学指标的测定(1)糖水偏爱实验(Sucrose preference test)在糖水适应阶段,每笼小鼠分别放两个1%(w/v)的蔗糖水瓶。每隔7天晚上固定时间(21:00~22:00)做糖水偏爱实验。每只小鼠单独放在一个鼠笼,一瓶自来水,一瓶蔗糖水,测定在1h时间内喝水量。统计小鼠的糖水偏爱分数:糖水/(糖水+自来水)╳100%。(2)自发活动(Spontaneous Activities)把小鼠放在自发活动仪器暗箱底部中间位置,箱顶安装摄像装置,记录小鼠在5min内的运动情况,通过Ethovision XT软件处理记录的运动图像,分析小鼠运动的平均速度。(3)悬尾实验(TST)用医用胶带将小鼠尾尖固定在测试箱的重力传感器上,正式实验开始前先观察一只小鼠处于不动状态时的数值,该数值设为阈值,并记录小鼠在6min内的不动时间,取后5min内的不动时间统计分析。3、免疫荧光标记先将石蜡切片脱蜡冲洗,用EDTA缓冲液修复,3%过氧化氢溶液孵育10min后,用5%BSA封闭20min,封闭结束后加入50μl稀释的SIRT1抗体(1:2000)、Iba-1抗体(1:2000),抗体孵育过夜。24h后二抗避光孵育1h后,每张切片加50-100μL DAPI,避光染核5min,稍后用封片剂封片,放在4℃保存,注意避光。4、小鼠脑组织尼氏染色用4%的多聚甲醛将小鼠脑组织固定,包埋石蜡,切片(4μm),将切片的组织浸泡在1%的甲苯胺蓝中,50°C染色20min,之后用双蒸水冲洗干净并固定,用荧光显微镜观察切片并采集图像。5、细胞的培养及干预小鼠BV2细胞株,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。待细胞生长状态较好时,将细胞传代至六孔板中,按照一定的时间顺序分别用IFNγ、Res、NAM干预细胞。干预结束后收集细胞和细胞培养基备用。6、ELISA测小鼠血浆及细胞培养基中细胞因子收集小鼠血浆和细胞培养基上清,根据affymetrix e Bioscience ELISA试剂盒说明书操作,检测小鼠血浆和细胞培养基上清中TNF-α和IFNγ的浓度。7、Western-blot用RIPA裂解液提取脑组织和细胞的总蛋白,用BCA法测定蛋白浓度,100°C 10min完成蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5h,转膜1.5h,封闭2h,孵育一抗过夜,漂洗8min 3次,孵育二抗1.5h,漂洗8min 3次后,显影,条带采用Image J图像分析软件进行灰度分析。8、统计方法使用SPSS16.0软件进行统计分析,Excel 2007和graph Pad整理数据和绘制图表,用Image J软件分析Western条带灰度值。统计方法为两独立样本t-检验,结果以P<0.05为显著性水平,P<0.01为非常显著性水平。实验结果1、应激35D成功建立小鼠抑郁模型(1)应激对小鼠行为的影响慢性不可预知应激35天后,与Con组比较,Stress组小鼠出现行为学变化,三个行为学指标差异均具有统计学意义。糖水偏爱实验(Sucrose preference test)中,Stress组糖水偏爱分数显著低于Con组(P<0.01);悬尾实验(TST)中,与Con组比较,Stress组5min内不动时间延长(P<0.05);自发活动实验(Spontaneous activity)中,5min内Stress组小鼠运动平均速度下降(P<0.05)。(2)应激对小鼠体重的影响结果表明,慢性不可预知应激35天后,与Con组比较,Stress组小鼠体重降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。慢性不可预知应激5周后,与Con组比较,Stress组小鼠附睾周围脂肪与体重的比值下降,且差异有统计学意义(P<0.05)。2、激活SIRT1的表达改善应激小鼠抑郁样行为和炎症水平(1)激活SIRT1对小鼠抑郁样行为的影响从应激第3周开始,每天给予小鼠25mg/kg剂量Res,应激35天时抑郁小鼠的行为学指标(糖水偏爱实验、自发活动实验和悬尾实验)得到改善,恢复到对照组水平。(2)Res对应激小鼠前额皮质及海马中SIRT1、AMPK、GSK3β蛋白表达的影响与Con组相比,应激35天小鼠前额皮质和海马中的SIRT1、p-SIRT1、AMPK、p-AMPK表达显著下降,GSK3β表达升高。与Stress组相比,Stress+Res组SIRT1、p-SIRT1、AMPK、p-AMPK表达升高,GSK3β表达下降,恢复到对照组水平。(3)Res对应激小鼠脑组织小胶质细胞中SIRT1的影响应激35天后,小鼠脑组织中的小胶质细胞数量显著增加,说明慢性应激会激活小胶质细胞。同时应激组神经元中SIRT1含量下降,而给予Res可以抑制SIRT1的下降。Iba-1与SIRT1双标结果显示,Stress组小胶质细胞中SIRT1含量下降。Stress+Res组小胶质细胞中的SIRT1恢复到正常水平,提示小鼠抑郁样行为的改善可能与激活SIRT1的表达相关。(4)激活SIRT1对应激小鼠脑组织形态学的影响尼氏染色结果显示,尼氏小体呈三角形或椭圆型块状,颜色为紫蓝色。慢性不可预知应激使皮层和海马CA3区神经元尼氏小体显著减少,细胞壁变薄,说明慢性不可预知应激引起了神经元的损伤。同时染色结果显示,Stress+Res组小鼠前额皮质和海马中的尼氏小体恢复到对照组数量和状态。(5)激活SIRT1对应激小鼠血浆中TNF-α、IFNγ浓度的影响ELISA结果显示,与Con组比较,小鼠在应激35天后血浆中TNF-α和IFNγ炎性因子浓度升高,差异具有统计学意义;而与Stress组比较,Stress+Res组小鼠血浆中IFNγ和TNF-α炎性细胞因子浓度下降,差异有统计学意义。3、SIRT1通过抑制GSK3β调控小胶质细胞炎症反应(1)IFNγ激活BV2小胶质细胞用25 ng/ml IFNγ分别干预BV2细胞24h、48h和72h,Western blot结果显示,IFNγ干预24h,BV2细胞中SIRT1、AMPK蛋白表达下降,而GSK3β蛋白表达增加。(2)Res激活SIRT1蛋白表达Western blot结果显示,用20μM Res干预BV2细胞24h,可以激活SIRT1蛋白的表达,而且Res对SIRT1的激活作用是剂量依赖性的,当干预浓度超过一定范围时,Res对SIRT1的激活作用逐渐减弱。(3)NAM抑制SIRT1蛋白表达用30m M NAM干预BV2细胞24h可以抑制SIRT1蛋白的表达,用IFNγ、Res、NAM同时干预细胞发现,NAM会抑制Res对SIRT1的激活作用。(4)SIRT1对细胞培养基中TNF-α、IFNγ浓度的影响ELISA结果显示,与Con组比较,25 ng/ml IFNγ干预BV2细胞会增加TNF-α和IFNγ的释放,使其浓度升高,且差异有统计学意义(P<0.05);与IFNγ组比较,IFNγ+Res组TNF-α和IFNγ浓度显著下降,且差异有统计学意义(P<0.05),提示用Res干预BV2小胶质细胞可以抑制TNF-α和IFNγ的释放。结论本实验通过慢性不可预知应激建立BABL/c小鼠抑郁模型,并通过激活SIRT1改善小鼠的抑郁样行为和炎症水平,初步验证了SIRT1在抑郁症的作用机制,得出如下结论:1、慢性不可预知应激5周后,小鼠表现出典型的抑郁样行为,模型建立成功。2、SIRT1表达下降可能是应激组小鼠表现出抑郁样行为的原因之一。3、激活SIRT1的表达会抑制GSK3β的表达,提示SIRT1可能通过抑制GSK3β发挥抑炎作用。4、慢性应激会引起神经元损伤,而激活SIRT1的表达可以改善小鼠的神经元形态,表明SIRT1有保护神经元的作用。5、SIRT1可通过抑制小胶质细胞GSK3β发挥抑炎作用。综上说明,SIRT1是机体代谢性炎症反应的重要调节因子,应激时SIRT1表达下降,激活SIRT1的表达会抑制GSK3β而起到抑制炎症反应的作用,并改善小鼠抑郁样行为。