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卵黄蛋白原(vitellogenin,Vtg)是卵黄蛋白的前体,通过下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)轴激活雌激素受体来合成。卵生脊椎动物的卵可以储蓄大量的卵黄,卵黄的主要成分是被称之为雌性成熟期血清蛋白的卵黄蛋白原。Vtg是合成卵黄过程中的关键性物质,是鱼类生殖过程中重要的生殖蛋白,在卵生动物生殖和发育过程中起重要作用[1]。研究卵黄蛋白原的合成机制不但可以补充完善鱼类生理学、发育生物学等基础研究,同时,掌握卵黄蛋白原体内体外合成方式和机理,可以为鱼类繁殖提供理论依据。为更好地了解金钱鱼(Scatophagus argus)卵黄蛋白原合成机制及能更精确地分析外源性雌激素对鱼类合成卵黄蛋白原的影响,本文以金钱鱼为研究对象,运用基因克隆、荧光定量PCR和H.E.染色等方法,并从泄殖孔腹腔注射EE2(17α-ethynylestradiol)和体外EE2暴露肝原代细胞两个角度对金钱鱼在EE2处理下的合成规律做了进一步的分析。本研究使用RACE克隆得到金钱鱼金钱鱼卵黄蛋白原基因的三种亚型的cDNA序列,金钱鱼vtgAa的GenBank登录号为KY676847,cDNA全长5360 bp,开放阅读框(ORF)为5091 bp,共编码1696个氨基酸。预测金钱鱼VtgAa蛋白分子量为186.07 ku,等电点为9.16,N端的前15个氨基酸为信号肽(图1-3)。金钱鱼vtgAb的GenBank登录号为KY654346,cDNA全长5346 bp,ORF为5100 bp,共编码1699个氨基酸。预测金钱鱼VtgAb蛋白分子量为186.37 ku,等电点为9.24,N端的前15个氨基酸为信号肽(图1-3)。金钱鱼vtgC的GenBank登录号为KY676848,cDNA全长4244 bp,ORF为3828bp,共编码1275个氨基酸。预测蛋白分子量142.87 ku,等电点6.43,信号肽为N端前15个氨基酸(图1-3)。根据H.E.染色的结果显示:本实验所处理的金钱鱼皆处于性腺发育过程中的未成熟期,满足EE2注射实验的前提条件。因此推测注射后合成的卵黄蛋白原主要为注射EE2的诱导结果。本实验使用灌流法从金钱鱼肝脏组织上分离得到金钱鱼肝细胞[2](图3-1),将分离得到的肝细胞进行原代培养至第三代后使用EE2暴露处理。根据RT-qPCR分析结果显示,在不同的采样时间及不同剂量的EE2注射条件下,腹腔注射EE2的肝组织中vtgAb基因表达均高于其他两种亚型,选取vtg Ab作为mRNA表达水平检测的主要基因(图2-5)。根据注射EE2后肝组织中vtgAb的RT-qPCR结果显示,vtgAb在EE2浓度为1.0μg/g和10.0μg/g处理时表达水平较高,而在浓度为0.01μg/g和0.1μg/g时表达水平较低(图2-6)。在表达时间上:24h时vtgAb表达水平较低,48h时表达量逐渐升高并在72h达到最高,在96h时表达量呈下降趋势。金钱鱼肝细胞内vtgAb基因的表达量在EE2暴露浓度为10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L时表达量较高,其中10-5 mol/L时的表达量较低于10-6 mol/L时的表达量(图3-2)。而在EE2暴露浓度为10-11 mol/L时,表达量最低。从表达时间上来看:vtg Ab基因从24h开始表达,在48h表达量逐渐升高并在72h时达到最高,在96h时表达量下降至较低于48h表达量,我们推测EE2诱导了肝脏内vtgAb基因的表达。