【摘 要】
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根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)已被广泛用于双子叶植物遗传转化,近几年,虽然在小麦上取得了突破性进展,但所报道的多是模式植株(如 Bobwhite)和报告基因(如 GUS).因
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根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)已被广泛用于双子叶植物遗传转化,近几年,虽然在小麦上取得了突破性进展,但所报道的多是模式植株(如 Bobwhite)和报告基因(如 GUS).因此拓宽小麦农杆菌转化的基因型范围,进一步完善转化体系都是及其必要的.该研究根据已测得的BYDV-GPV株系复制酶基因序列,分别设计合成含有酶切位点BamHI的相应上、下游引物,以病毒RNA为模板,通过RT-PCR方法分别获得病毒的全长复制酶基因ORF1(1953个核苷酸)和ORF2(1872个核苷酸).将所得到的片段直接与pGEM-T Easy载体相连,通过酶切、PCR及序列测定,得到中间载体pGEM-TO1和pGEM-TO2.再经过BamHI酶切后插入到相同酶切的双元载体pBI121上,构建成植物表达载体pPPI20(含反向插入的ORF1)、pPPI21(含正向插入的ORF2).通过冻融法或电激法将pPPI20导入根癌农杆菌菌株EHA105、LBA4404中;将pPPI21导入根癌农杆菌菌株EHA105、AGLI中,用于转化小麦.研究证明,以预培养7天的幼胚为受体进行转化所得到的转基因植株是最多的.所以产生胚性愈伤组织之前的幼胚或小愈伤组织是比较理想的受体.对影响小麦组织培养条件和转化的主要因素进行了研究.在小麦组织培养中,小麦植株再生率低和基因型依赖性很强是限制转基因成功的瓶颈.
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