流感病毒感染是严重威胁人类健康的最常见的原因之一。1930年R.E.Shope成功的用病猪呼吸道过滤液感染雪貂,分离出了猪流感病毒[1]。1933年Smith等人将首次从人体中分离到的病毒称甲型流感病毒[2]。历史上第一次甲型流感大流行在1918年-1919年造成2000-4000万人死亡[3-4],本世纪初2009年的这次H1N1型流感病毒侵袭人类并造成世界范围内的广泛流行。流感病毒致病机制的研究一直都是医学研究的热点。2010年,刘彦明等[5]用免疫组织化学染色法检测病毒感染狗肾转化细胞(MDCK)之后细胞DNA鸟嘌呤的氧化损伤产物8-氧鸟嘌呤脱氧核苷(8-oxo-7,8-dihydroguanine,8-oxo-dG)的表达,实验结果证实甲型H1N1 (Influenza A)流感病毒感染能造成宿主细胞DNA氧化损伤,氧化应激的后果不仅是造成蛋白质、脂质的氧化,还会造成核酸的氧化。另一研究表明H1N1型流感病毒能明显诱导宿主MDCK细胞凋亡,凋亡率随着检测时间推移升高[41]。在各种碱基中,鸟嘌呤最易被氧化成8-氧鸟嘌呤脱氧鸟苷(8-oxo-dG)[6]。DNA上的8-oxo-dG既可以由于原位氧化,也可由复制过程8-oxo-dGTP的错误掺入而致。人类细胞内DNA的低氧化状态维持依赖多种基因修复酶,其中8_羟基鸟嘌呤核苷酸酶(MutT homologue 1,MTH1)可以水解核苷酸代谢池中的8-oxo-dGTP为8-oxo-dGMP,阻断错误掺入过程[7];而8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-oxo-guanine DNA glycosylase1,OGG1)能够清除DNA上无论是由于原位氧化还是错误掺入而形成的8-oxo-dG[8]。两种酶在不同阶段的共同作用预防DNA的氧化或减轻DNA的氧化损伤,从而使DNA的正常低氧化状态得以维持。2008年2月份DNA Repair杂志刊登Hill的文章,作者发现氧化应激所致的培养细胞DNA过度氧化与OGG1的降解有相关性[9]。同时,我们的前期研究结果表明流感病毒感染靶细胞后,会导致靶细胞内氧化损伤标志物8-oxo-dG表达量增加,提示了细胞发生氧化应激损伤,最终引起靶细胞凋亡,根据上述研究进展,我们认为氧化损伤修复酶参与DNA过度氧化修复过程,可能在流感病毒致宿主细胞凋亡发生发展的过程中起到一定的作用。目前国际上对流感病毒感染后宿主细胞DNA氧化损伤机制的研究鲜有报道,本研究将从DNA氧化损伤修复方面探讨流感病毒致病机制。目的本课题在流感病毒感染宿主细胞可导致脂质氧化损伤和DNA碱基氧化损伤的基础上,进一步探讨其可能的作用机制。揭示流感病毒致宿主细胞的氧化损伤在宿主细胞凋亡中的作用,即DNA的过度氧化损伤而氧化修复酶的表达不足以对抗过高的氧化损伤,最终导致宿主细胞的凋亡和症状的发生发展。本研究旨在加强对流感病毒致宿主细胞氧化应激机制的认识,为该病毒致病机理研究提供了新的思路,为抗流感药物的开发提供新的靶点,也为高致病性人禽流感的预防、防控提供了新的视角和依据。方法第一部分流感病毒感染细胞模型的建立采用细胞培养技术培养MDCK细胞。鸡胚尿囊腔接种H1N1型流感病毒,经病毒复制、扩增、收获病毒,通过检测MDCK细胞的半数组织细胞感染剂量(TCID50),确定该毒株实验用毒剂量。第二部分流感病毒H1N1感染细胞后MTH1基因表达的研究细胞培养后提取总RNA,经优化RT-PCR反应检测细胞内MTH1基因的表达量。条带经Scion Immage软件分析并与内参基因GAPDH相比,对体系的准确性、重复性和灵敏度进行分析。MDCK细胞培养后,H1N1型流感病毒感染0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h,在各时间点进行检测:经RT-PCR反应检测细胞内MTH1基因的相对表达量。第三部分流感病毒H1N1感染细胞后OGG1基因的表达的研究MDCK培养后提取RNA,反转录成cDNA,设计引物进行聚合酶链式反应对目的基因OGG1进行扩增同时条带经Image J软件分析并与扩增的内参基因GAPDH相对比,检测体系的准确性、重复性。MDCK细胞培养后,流感病毒感染0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h,在各时间点进行检测:采用PCR仪检测细胞OGG1基因的表达量变化。结果1.成功培养MDCK细胞,同时培养H1N1流感病毒,测得该毒株感染MDCK细胞的TCID50为10-3.91/0.1ml,实验用毒剂量为100 TCID50。2.(1)扩增产物经测序分析证实与GenBank中MTH1基因序列一致;(2)灵敏度检测发现最低可从50 ng总RNA中检出目的基因的表达。(3)重复性测定发现,MDCK细胞MTH1与GAPDH灰度值比值的均值为2.02±0.09 (n=10),CV值为4.31%。甲型H1N1流感病毒感染后0 h、6 h、12 h,MTH1基因的表达量与正常对照组无显著性差别,感染后1 h、3 h小时MTH1基因的表达量显著高于正常对照组,感染后24 h、48 h表达量显著低于正常对照组。3.引物设计合理,能够扩增出内参基因和目的基因,扩增产物经测序分析证实与GenBank中OGG1基因序列一致。重复性测定发现,MDCK细胞OGG1与GAPDH表达灰度值比值的均值为0.84±0.025 (n=6),CV值为2.99%。甲型H1N1流感病毒感染后0 h、48 h OGG1基因的基因的表达量与正常对照组无显著性差别,感染后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、OGG1基因的表达量显著高于正常对照组。结论经研究发现:MTH1基因表达的半定量RT-PCR检测方法的特异性扩增条带的片段大小不仅与预期一致,其碱基序列也与GenBanK序列完全匹配,而阴性对照无阳性扩增,证实本方法具有极好的特异性,其阳性完全为MTH1 mRNA的RT-PCR产物。对其重复性检测则证明本体系具有较好的重复性。综上,本体系具有极好的准确性、较高的灵敏度和重复性,而且对设备要求低、操作简便。这一体系的建立对开展细胞内MTH1 mRNA表达研究、尤其是流感病毒感染相关研究奠定良好基础。RT-PCR检测流感病毒H1N1感染细胞后MTH1基因的表达量的变化研究发现,与对照组比较氧化损伤修复基因MTH1在换病毒液一小时后表达量有所上调持续到更换维持液后3h,到6h后开始下降到正常水平持续至12h,到实验监测点的24h及48h MTH1的表达显著低于对照组。MTH1可以保护DNA避免受到氧化损害,说明在病毒感染初期细胞发生氧化损伤后及时启动MTH1的上调来增加抗氧化能力,而到病毒感染细胞的后期阶段细胞凋亡的增加,细胞MTH1的表达受到抑制,DNA氧化修复能力下降,随着感染所至损伤的不断加深,氧化应激产物的增加形成恶性循环从而促使细胞死亡。方法学研究发现OGG1基因的扩增片段其大小与预期一致,测序结果也与GenBanK序列完全匹配, H1N1流感病毒感染细胞的OGG1基因mRNA表达水平从换病毒维持液1h到24h持续增加,OGG1基因的上调可增加细胞对DNA氧化损伤的修复能力,到48小时降低,可能是此时凋亡因素占据上峰OGG1基因表达下降,在流感发生和防御机制中起到作用。而此前, 2009年柯跃斌等,利用H2O2作用于Ⅱ型人类肺泡上皮细胞A549发现:hOGG1 mRNA的表达水平也因H2O2暴露而24h内均呈上升趋势。本实验研究从氧化应激角度探索流感病毒,加深对该病毒致宿主细胞氧化应激机制的认识。