研究背景和目的人胚胎干细胞（hESC）是从人类早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的高度未分化的多能性细胞，具有无限增殖的能力，并经诱导可分化为不同类型的组织细胞。因此，人胚胎干细胞可作为理想的实验材料而用于医学、生物学、药学等方面的研究。目前认为与维持hESC分化潜能相关的转录因子是Oct4、Nanog和Sox2，对这组转录因子上游调控信号通路的研究目前主要集中于IGF、FGF受体以及TGFβ通路的研究，表观遗传调控通路的研究鲜有报道。2007年Nature杂志报道，有研究者通过向早期鼠胚（2~4细胞期）卵裂球显微注射共刺激因子相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1）后，卵裂球内染色体的组蛋白甲基化水平升高，同时使卵裂球核内Nanog的水平显著升高，最终导致卵裂球向ICM分化。组蛋白修饰在hESC自我更新和分化中起着举足轻重的作用。组蛋白赖氨酸甲基化已被证明与hESC多能性维持以及体细胞的重编有关，而对组蛋白精氨酸甲基化相应的研究却是一片空白。CARM1作为一种组蛋白精氨酸甲基转移酶，其催化的位点包括组蛋白H3N端的l7、26位以及C端的128、129、131、134位精氨酸(H3R17，26，128，129，131，134)，对转录有直接调节作用的位点分别是H3R17和26。最近人们还找到了CARM1的特异性抑制剂，这为CARM1的功能研究提供有利条件。MicroRNAs（miRNAs）是一段包含18~22bp长度的RNA分子，在体内也可以接受各种信号转导通路和转录因子变化的调控，通过碱基互补与靶mRNA部分或者完全结合，诱导靶mRNA的切割或者翻译抑制，调控基因的表达。已有研究者筛选出了在ESCs中特异性表达的miRNAs，最近的研究还发现上百条miRNAs在hESC分化前后出现了显著的表达差异。本实验发现共刺激因子相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1）不仅能影响早期鼠胚细胞中Nanog的表达水平，还能影响hESC中Nanog的表达。同时运用生物信息学的方法，我们预测了靶向CARM1的12条miRNAs，并最终证明MicroRNA181家族能直接靶向CARM1，调控其在hESC中的表达。综上所述，本研究证明了CARM1在维持hESC多能性过程中扮演重要作用，揭示了组蛋白甲基化修饰、microRNA转录后调控协调参与到hESC的多能性调控网络中的方式和机制，为hESC多能性调控找到一条全新的表观修饰通路。第一部分：CARM1对早期鼠胚细胞和hESC多能性的影响方法:(1)CARM1mRNA的合成以及重组质粒pcDNA3.1-flag－-CARM1的构建：通过PCR获得CARM1全长模板，使用mRNA体外合成试剂盒合成CARM1mRNA。将CARM1全长片段连接入pcDNA3.1-flag－载体中，获得pcDNA3.1-flag－-CARM1真核表达载体。(2)早期鼠胚中CARM1过表达模型和hESC中CARM1过表达模型、knock-down模型的建立以及分析：通过显微注射系统将CARM1mRNA注射入二细胞期鼠胚的其中一个细胞。利用脂质体将pcDNA3.1-flag－-CARM1质粒转染入hESC中。设计CARM1特异性siRNA，利用脂质体转染入hESC中，构建CARM1的knock-down模型。分别通过免疫荧光法和Realtime-PCR法、Westernblot法等检测各模型中Nanog等转录因子的表达情况，利用Realtime-PCR法检测CARM1的knock-down模型中三胚层分化Marker的表达情况，利用碱性磷酸酶（AP）染色比较CARM1knock-down组与对照组之间hESC的形态差异。(3)CARM1对hESC诱导分化后的形态变化的影响：通过撤除培养基中的bFGF诱导hESC分化，利用碱性磷酸酶（AP）染色比较CARM1过表达组与对照组之间hESC的形态差异，结果：(1) CARM1mRNA长度在2000nt以上，与预计长度相同。pcDNA3.1-flag－-CARM1重组质粒测序鉴定，与CARM1序列完全匹配。(2) CARM1mRNA注射入早期二细胞期鼠胚其中一个细胞，发育至四细胞期后的注射组细胞Nanog水平上调。hESC中过表达CARM1后，Nanog水平和对照组比较显著升高。Knock-down CARM1后，Nanog水平和对照组比较显著下调，三胚层分化Marker的表达水平显著上调。CARM1knock-down组与对照组比较克隆形成数减少，形态减小，AP染色阳性克隆显著减少。(3)CARM1过表达组与对照组相比，能在一定时间内维持hESC克隆的形态与数量。结论：(1)CARM1mRNA的合成以及重组质粒pcDNA3.1-flag－-CARM1的构建成功。(2)CARM1能上调早期鼠胚细胞以及hESC中Nanog的表达水平。(3) CARM1能维持hESC的多能性，抵抗分化。第二部分：CARM1维持hESC多能性机制的研究方法:在hESC的CARM1过表达模型和knock-down模型中，利用ChIP技术分别分析Nanog、Oct4、Sox2分子启动子区CARM1以及H3R17甲基化水平的变化。结果：CARM1过表达模型中Nanog、Oct4、Sox2分子启动子区有CARM1和H3R17甲基化的富集。CARM1knock-down模型中上述转录因子启动子区CARM1和H3R17甲基化水平均显著下调。结论： CARM1能通过催化Nanog、Oct4、Sox2等转录因子启动子区H3R17的甲基化修饰，激活转录，上调Nanog的水平，从而维持hESC的多能性。第三部分：miR-181通过靶向CARM1影响hESC多能性方法:(1) hESC诱导分化过程中CARM1的表达水平以及组蛋白精氨酸甲基化水平差异的研究：通过撤除培养基中的bFGF诱导hESC分化，利用Realtime-PCR检测hESC促分化后CARM1转录水平的变化，利用Westernblot技术检测hESC促分化后CARM1翻译水平的变化以及组蛋白H3R17甲基化水平的变化(2) hESC中靶向CARM1的miRNAs的确定：通过Targetscan网站，预测12条直接靶向CARM13端非翻译区(3’UTR)的miRNAs，利用Realtime-PCR技术检测上述12条miRNAs在hESC促分化后的表达情况，筛选出在hESC促分化后高表达的miRNAs作为候选miRNAs。然后在HEK293细胞中利用双荧光素酶报告系统实验确定候选miRNAs是否能靶向CARM1的3’UTR。（3）miR-181对hESC多能性影响的研究：筛选出miR-181家族miR-181a/b/c/d后，选取miR-181c，合成miR-181c的mimics，利用脂质体转染入hESC中，检测CARM1的表达情况，同时检测Nanog、Oct4、Sox2等转录因子以及三胚层分化Marker的表达情况，利用AP染色比较miR-181c过表达组与对照组之间hESC的形态差异。（4）外源性CARM1恢复miR-181造成的多能性丧失的研究：将miR-181cmimics和无3’UTR的CARM1表达载体pcDNA3.1-flag－-CARM1共转染入hESC中，检测Nanog、Oct4、Sox2等转录因子的表达情况，利用AP染色比较共转染组与miR-181c过表达组之间hESC的形态差异。结果：(1) hESC促分化后，CARM1转录和翻译水平均显著下调，H3R17甲基化水平亦显著下调。(2) miR-181家族miR-181a/b/c/d的表达在hESC促分化后均显著增加，双荧光素酶报告系统实验提示miR-181家族的四条miRNAs均能靶向CARM1的3’UTR（3）miR-181c过表达后，hESC中CARM1显著下调，Nanog、Oct4、Sox2表达均下调，三胚层分化Marker的表达显著上调。miR-181c过表达组与对照组比较，hESC克隆形成数减少，形态减小，AP染色阳性克隆显著减少。（4）miR-181c和CARM1表达载体的共转染组Nanog、Oct4、Sox2表达较miR-181c过表达组显著上调，三胚层分化Marker下调，AP染色阳性克隆数增加。结论：(1) hESC促分化过程中CARM1下调，组蛋白精氨酸甲基化水平下调，影响hESC多能性的维持。(2) miR-181能直接靶向CARM1，是CARM1的上游调控分子。（3）miR-181c能通过下调CARM1的表达，影响或部分影响hESC多能性的维持，促进hESC分化。（4）CARM1能在一定程度内恢复hESC多能性。小结本研究验证了早期鼠胚细胞中CARM1能上调Nanog的表达水平，提出并证实了在hESC中CARM1能通过催化Nanog、Oct4、Sox2启动子区组蛋白H3R17的甲基化修饰，上调Nanog的表达，从而维持hESC的多能性。本研究成功筛选并验证了在hESC中能调控CARM1的上游信号分子miR-181。尽管MicroRNAs参与干细胞多能性调控的通路屡见不鲜，但是microRNA与组蛋白甲基化修饰，特别是与组蛋白精氨酸甲基化修饰协同参与表观遗传学调控的通路未见报道，本研究首次提出并证实了miR-181通过靶向CARM1，影响Nanog表达水平，并最终影响hESC多能性的通路，为hESC多能性的维持找到了新的有效的手段。