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新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)强毒株感染引起禽类、水禽以及野生禽类的一种重要传染病,也是我国畜牧业“十三五”发展规划及《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》中重点防控的五大一类动物疫病之一。目前已知NDV HN与F蛋白决定病毒毒力,NP、P、L及M蛋白也在病毒感染进程中发挥作用,此外NDV感染还会触发细胞凋亡及自噬效应,影响病毒在细胞间的传播。然而NDV的致病机制尚未得到完全的解释,随着生物研究领域的不断扩展,NDV感染、增殖与致病机制都在不断补充和完善。外泌体(Exosome)是细胞分泌的直径在30-120nm的囊膜小泡。外泌体可以在细胞间传递脂质、蛋白质及遗传物质,从而形成以外泌体为桥梁的细胞间信息传递系统,参与细胞迁移、细胞增殖、细胞活化或组织损伤修复等过程。研究表明外泌体与病毒感染以及宿主抗病毒免疫反应关系密切,外泌体可以通过携带完整感染性病毒粒子或病毒组分在病毒感染进程中发挥作用。目前NDV感染与外泌体之间的关系仍不清楚,为此,本研究以外泌体为切入点,通过对外泌体中病毒组分的检测及外泌体在病毒感染进程中影响的分析,明确外泌体与NDV间的相互作用关系。外泌体生物学功能研究的前提是得到高纯度外泌体样品,而外泌体与NDV粒子物理性质相似,导致无法用常规方法将二者分离。因此,本研究首先建立了一种利用proteinA/G磁珠联合鸡CD63抗体的鸡源外泌体分离方法并对所得产物进行检测。Western Blot结果显示产物表达外泌体标志蛋白TSG101,透射电子显微镜观察显示所得产物直径在40nm左右,且具有典型碟状外泌体形态,说明成功取得鸡源NDV相关外泌体(NDV Ex)。进而本研究检测了NDV Ex的感染性以及NDV Ex中的病毒组分。q-PCR和Western Blot检测结果显示NDV Ex中包含病毒W、V和F蛋白,但不存在HN和M蛋白以及病毒基因组。进一步探索NDV Ex在鸡巨噬细胞中对NDV增殖的影响。结果显示,NDV Ex对病毒复制的影响与感染时长及病毒初始滴度有关。MOI=0.1时,NDV Ex在3-6h NDV NP基因无显著变化,9h时NP基因水平轻微下调,12h时则明显下调,24h时NP水平又表现出明显上调。也就是说NDV Ex 12h抑制病毒复制,24h则发挥促进作用;MOI=1时,NDV Ex 3h对NDV无影响,6-9h下调NP基因水平,12h基本恢复平稳,24h表现出上调作用。表明NDV Ex 6h开始抑制病毒复制,12h恢复平稳,24h促进病毒增殖。通过对鸡巨噬细胞(HD11)活化分子及抗病毒细胞因子的检测发现,NDV Ex前期诱导HD11活化,同时促进IFN-β及ISGs的表达,抑制NDV复制,后期抑制HD11活化及IFN-β和ISGs的表达从而促进NDV复制。以上结果表明NDV Ex前期通过诱导巨噬细胞活化造成免疫激活的现象,为后期NDV复制及传播提供便利。综上所述,本文首先分离NDV相关外泌体并分析其中存在的病毒组分,进一步检测NDV Ex及其中的病毒蛋白对NDV增殖的影响,并初步探索其在病毒感染进程中的作用机制。结果显示NDV Ex在病毒感染进程中调节巨噬细胞活化程度及抗病毒细胞因子的表达,表明外泌体是参与NDV感染与复制的重要途径。