链黑菌素是一类具有氨基喹啉醌结构的抗生素,1959年从柔毛链霉菌Streptomyces CGMCC4.1223中分离得到。链黑菌素对于多种肿瘤都具有良好的抑制效果,同时它还有抗病毒、抗细菌和抗真菌的活性,但由于其具有毒性,无法在临床上广泛应用。链黑菌素特殊的性质和独特的化学结构,吸引了众多化学家、药学家、生物学家的广泛关注。stnA作为链黑菌素生物合成通路基因簇中的上游边界基因,其翻译表达的StnA蛋白的主要功能是水解10′-去甲氧基链黑菌素甲酯产生10′-去甲氧基链黑菌素,由于其产物具有“高活性、低毒性”的优点,我们希望用10′-去甲氧基链黑菌素来代替链黑菌素进行临床治疗。因此我们解析了StnA蛋白的晶体结构,通过结构和功能的关联分析,阐明了StnA蛋白催化位点、结合位点、稳定性、底物选择性等科学问题,为其在工业上的广泛应用提供了理论基础。本研究通过对野生型StnA、硒代甲硫氨酸衍生蛋白、S185A突变体蛋白的表达、纯化、晶体筛选和优化、结构解析等一系列X射线衍射晶体学的方法,成功获得了StnA硒代甲硫氨酸衍生蛋白的单晶结构和S185A突变体与底物STM复合物共晶的结构。通过对StnA晶体结构的分析,我们发现其结构主要由α/β折叠结构域和帽子结构域两部分组成,帽子结构域中的α4和α7、G3反向平行,并和一些长loop组成了底物结合口袋。StnA蛋白的催化三联体为Ser185-His349-Asp308,其中Ser185作为亲核攻击的氨基酸残基,氧离子洞由Ala102和Leu186主链上的N原子构成,这些结构特征均符合α/β水解酶家族的典型特征,根据这些共性我们还进一步推测出StnA水解底物的催化机理。通过序列比对、结构比对、进化关系分析,发现了StnA蛋白拥有不同于其他α/β水解酶家族成员的特点。大部分α/β水解酶的底物结合口袋均位于α/β折叠结构域和帽子结构域之间,而StnA蛋白的底物结合口袋完全位于帽子结构域。大部分的酯酶或脂肪酶都会形成一些二级结构元件来保护活性位点,StnA蛋白既没有底物进出通道,也没有所谓的“开关”调节机制,其底物结合方式完全不同于其他酯酶或脂肪酶。因此我们认为StnA拥有一种全新的底物结合模式。之后我们又利用干湿实验相互验证的方法,阐明了底物STM与StnA蛋白之间主要通过疏水相互作用来稳定,同时蛋白上的Ala282和Asn277与底物形成氢键。通过构建定点突变,利用生物薄膜表面干涉技术测定酶亲和力常数,发现其结果与分子动力学模拟得到的结合自由能数据有很好的线性回归关系,验证了模拟的可靠性和鲁棒性。同时,利用分子动力学模拟的方法,完善了晶体学所无法解释的一些问题。阐明了StnA结构中的两个二硫键(C64-C85和C312-C319)对蛋白质的稳定性和维持底物结合口袋的形状起关键作用。对于同样是链黑菌素生物合成通路中的中间产物淡紫醌霉素甲酯(LME),StnA就几乎不能水解,这是由于LME与StnA蛋白Ala282残基之间缺少氢键相互作用,使得LME在底物结合口袋中结合不稳定,在运动中容易逃离口袋。对于StnA N端60个至今未解析出结构的氨基酸残基,我们又从功能推测、软件预测、进化分析等多个角度大胆猜测StnA是一个膜(结合)蛋白。利用在线软件I-TASSER将StnA N端60个氨基酸补齐,并进行了分子动力学模拟,结果显示33-50号氨基酸形成的α螺旋锚定在膜上,两侧的两个长loop柔性很大,形成类似秋千一样的摆动,这一运动与顺式氨基酸Thr77所在的β1与β2之间的loop有一定的动态相关性。之后运用膜(结合)蛋白的纯化方法对StnA全长蛋白进行了纯化,在去垢剂置换后的超速离心上清液中我们发现了目标蛋白,说明StnA全长蛋白确实存在于膜组分中。并且在含有非离子型去垢剂的情况下,StnA蛋白的水解活性有一定的提高。综上所述,本研究采用干湿结合的研究方法,利用了X射线衍射晶体学、酶学、分子动力学模拟、膜蛋白纯化等多种手段,形成了独具特色的交叉学科研究方法,从不同的角度阐释了链黑菌素生物合成通路中关键酶StnA的结构与功能的关系,为今后进一步的研究奠定了基础,同时为工业化大规模生物合成链黑菌素类似物提供了重要的科学与实践意义。