目的：通过对不同发育期大鼠DEHP暴露染毒,评价DEHP对大鼠的神经发育毒性作用及毒性敏感期。观察测定DEHP的毒性效应时间累积作用和成年大鼠神经系统自我修复对DEHP毒性的适应性。初步探索DEHP神经发育毒性可能的内分泌学机制。方法：1动物选择和染毒方式不同发育期各批次实验均选用成年健康雌性SD大鼠,待受孕后按照受孕时间、体重随机分为对照组和DEHP染毒组(剂量分别为2.5、5.0、50、500、1000 mg/kg bw)共6个组。DEHP剂量组通过经口灌胃暴露,对照组灌胃给予橄榄油灌胃。DEHP暴露染毒时间分别为GD6至分娩(胎儿期,通过孕鼠间接暴露)、PND1至断乳(婴幼儿期,通过母鼠间接暴露)、PND22至PND30(青春前期,子代直接经口暴露)、以及GD6到PND30(全部发育期,间接和直接暴露)。2神经发育毒性研究不同发育期大鼠暴露DEHP后,分别观察受试物对各发育期子代大鼠中枢神经系统的影响,检测指标包括：各期母鼠的一般情况以及生殖情况分析、子代大鼠早期生理发育指标(体重、成活率、耳廓分离时间、出牙时间、开眼时间和出毛时间)、子代大鼠早期神经发育指标(负趋地反射、平面翻正试验、悬崖回避、听觉惊愕、前肢悬挂、空中翻正试验)以及成年早期神经行为学测试(旷场试验、Morris水迷宫试验)等神经行为学指标；海马及脑皮层形态学观察(HE染色)以及脑重量、脑体比的测定；突触可塑性相关蛋白及基因表达情况(Western blot、荧光定量PCR)；大鼠下丘脑中神经肽表达情况(Western blot、放射免疫法)。3神经发育毒性内分泌机制学探究不同发育期大鼠暴露DEHP后,采集子代大鼠血液,获取海马组织,进行大鼠血清中雌激素水平以及甲状腺激素水平检测(酶联免疫法、放射免疫法)；大鼠海马组织中激素相关受体基因mRNA表达情况(荧光定量PCR)。结果：1. DEHP对母鼠一般毒性和子鼠生长发育的影响1.1孕鼠一般情况及生殖指标分析胚胎期、婴幼儿期、青春前期孕鼠体重及一般情况良好,未见明显中毒症状,各项指标未见明显改变。全部发育期暴露结果显示,1000mg/kg bw剂量组孕鼠妊娠期出现轻度的延长,每窝的产子数与对照组相比出现明显减少,子鼠出生存活率、4d、21d存活率均出现降低(P<0.05)。1.2子鼠生长发育情况胚胎期、婴幼儿期、青春前期暴露阶段各组各性别子代大鼠哺乳期体重与对照组相比未见显著差异(P>0.05)。全部发育期暴露结果显示,50mg/kg、1000mg/kg剂量组子代雄性和雌性大鼠在哺乳期体重与对照组相比出现降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。各暴露阶段子代大鼠耳廓分离时间、出牙时间、开眼时间和出毛时间等早期生理发育指标与对照组相比未见现显著性差异(P>0.05)。2 DEHP暴露对大鼠神经行为发育的影响2.1 DEHP对大鼠早期神经行为发育的影响胚胎期暴露DEHP显示,50、500和1000mg/kg bw DEHP剂量组大鼠的平面翻正反射、悬崖回避反射和空中翻正反射的达标天数分别出现延后现象(P<0.05),同时前肢悬挂时间与对照组相比明显缩短(P<0.05)。各剂量组大鼠的负趋地反射和听觉惊愕达标时间与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。婴幼儿期暴露DEHP显示：50、500和11000mg/kg DEHP剂量组空中翻正反射达标时间出现延后(P<0.05)。在全部发育期暴露后,5到1000mg/kg剂量组大鼠的负趋地反射和空中翻正反射达标时间延后(P<0.05),50、500和100mg/kg剂量组平面翻正反射达标时间延后、前肢悬挂时间缩短,500、1000mg/kg DEHP剂量组悬崖回避达标时间延后(P<0.05)。2.2旷场试验结果胚胎期暴露,50、500、1000mg/kgBW剂量组与对照组相比大鼠在中央格停留时间增加、跨格次数、直立次数、修饰次数明显减少(P<0.05),自主活能力下降(P<0.05)。全部发育期暴露DEHP后发现,5、50、500、1000mg/kg bw DEHP剂量组大鼠中央格停留时间增加,跨格次数减少(P<0.01)；500、1000mg/kg bw DEHP组大鼠直立次数减少；50、500、1000mg/kg bw DEHP组大鼠修饰次数出现减少(P<0.05)。婴幼儿期和青春前期暴露DEHP后未见自主活动受到抑制,各剂量组旷场试验结果与对照组相比未见显著性差异(P>0.05)2.3 Morris水迷宫试验结果隐性平台实验显示,随着训练时间的延长,各发育期子鼠训练后的逃避潜伏期逐渐缩短,表现出一定的学习记忆能力。可见平台试验显示,各期子鼠逃避潜伏期未见明显差异,这说明DEHP对仔鼠的视力和运动能力无影响,各组仔鼠不会因为视力和体力而影响学习记忆行为。胚胎期大鼠在训练第3-5天,50mg/kg bw以上剂量组大鼠的潜伏期与对照组相比明显延长(P<0.05)。50、500、1000mg/kg剂量组在目标象限的路程百分比和停留时间百分比均比对照组低(P<0.05),500、1000mg/kg剂量组穿越平台次数明显少于对照组(P<0.05)。全部发育期暴露大鼠在训练第3-5天,5mg/kg bw以上剂量组大鼠的潜伏期与对照组相比明显延长,(P<0.05)。5、50、500、1000mg/kg bw剂量组目标象限路程百分比、穿越平台次数均明显低于对照组(P<0.05),50、500、1000mg/kg剂量组目标象限停留时间百分比与对照组相比显著减少(P<O.05)。婴幼儿期、青春前期暴露DEHP后水迷宫试验各组未见出现统计学差异(P>0.05)。3 DEHP暴露对大鼠海马和脑皮质病理学的改变各期大鼠脑组织重量以及脑体比测量显示,剂量组脑重、脑体比于对照组相比,未见明显差异(P>0.05)。HE染色显示,胚胎期暴露DEHP后,1000mg/kg bw剂量组雄鼠大脑皮质锥体层神经细胞出现变性,核固缩深染,尼氏体消失,海马CA1区、CA2区、CA3区以及DG各区神经细胞排列紊乱。婴幼儿期暴露DEHP后,5mg/kg bw剂量组大脑皮质锥体层、多形层以及海马CA1、CA2、CA3及DG区网状神经毡出现空泡,呈海绵状,同时大脑皮质分子层、锥体层神经元出现核固缩深染；50mg/kg DEHP剂量组大脑皮质锥体层、多形层网状神经毡出现空泡,呈海绵状,大脑皮质分子层出现小胶质细胞增多；1000mg/kg DEHP剂量组大脑皮质锥体层、多形层以及海马CA1、CA2和CA3区网状神经毡出现空泡,呈海绵状。HE染色显示,青春前期暴露DEHP后,溶剂对照组、各DEHP剂量组大鼠大脑皮质、海马各区均未出现有意义的病理学改变。HE染色显示,全部发育期暴露DEHP后,1000mg/kg bw剂量组大脑皮质分子层小胶质细胞增多,分子层和锥体层界交界处神经元细胞分布杂乱,海马CA3区的小胶质细胞增多。海马DG区可见神经元核固缩深染。4 DEHP暴露对大鼠下丘脑中神经肽含量的影响胚胎期的500、1000mg/kg bw剂量组子鼠下丘脑中VP含量与对照组相比显著下降(P<0.05)。婴幼儿期暴露的50、500mg/kg剂量组子代大鼠下丘脑中ACTH含量同对照组相比显著升高(P<0.05),500、1000mg/kg bw剂量组子代大鼠下丘脑中NPY含量与对照组相比显著下降(P<0.05)。全部发育期的5、500、1000mg/kg bw剂量组仔鼠下丘脑中VP含量与对照组相比显著降低(P<0.01),2.5、5、50、500mg/kg bw剂量组子代大鼠下丘脑中ACTH的含量与对照组相比,显著降低(P<0.01),500、1000mg/kg bw剂量组NPY含量与对照组相比显著降低(P<0.05)。5 DEHP对海马突触可塑性相关蛋白以及基因表达的影响胚胎期、婴幼儿期和全部发育期暴露DEHP后,可在不同程度上引起PSD95、PKA、CREB、BDNF等蛋白表达水平降低；p-CAMKII在CAMKII中的比例降低,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)；各蛋白的基因表达水平也相应下调。6 DEHP对血清中甲状腺激素、雌激素水平以及相应激素受体表达水平的影响胚胎期、婴幼儿期DEHP暴露可轻度降低血清中甲状腺激素水平的改变。全部发育期暴露可显著降低仔鼠血清中T3、T4水平,同时升高TSH水平。青春前期暴露DEHP后未发现甲状腺激素水平的变化。各个发育期暴露DEHP后,均未对血清中雌激素E2含量产生影响。胚胎期暴露DEHP可下调500、1000mg/kg bw剂量组雄鼠ER-β的表达(P<0.05),对ER-α、THR表达未产生影响；婴幼儿期暴露DEHP可降低50、500、1000mg/kg bw剂量组雌鼠ER-β的含量(P<0.05),对ER-α、THR表达量未产生影响；在全部发育期,DEHP暴露后可使子鼠THR、ER-β表达量均出现下调,但ER-α的表达量不受影响。研究结论1.首次证实胚胎期、婴幼儿期、全部发育期暴露一定剂量的DEHP可对大鼠的早期神经行为发育以及成年后的学习记忆能力有不同程度的损伤。2.在本实验条件下,未发现青春前期暴露DEHP对大鼠产生神经发育毒性作用。首次证实大鼠胚胎期对DEHP的神经发育毒作用更为敏感,且在全部发育期内随着暴露时间延长,毒作用增强。3. DEHP可影响大鼠血清中甲状腺激素的水平,并能下调海马组织中THR、ER-β受体水平,这可能是DEHP对大鼠神经发育毒性作用的重要内分泌学机制；同时,突触可塑性相关蛋白及基因表达改变可能是DEHP致大鼠神经功能损伤的重要分子学机制。