目的:研究基于骨髓干细胞转化肝癌干细胞的肝癌发生发展机制,阐明体现“补肾生髓成肝”治疗法则的地五养肝胶囊对肝癌发生发展的影响及其机制,丰富“肝主生发”(“髓生肝”、“髓失生肝”、“补肾生髓成肝”)的科学内涵。方法:(1)80只4-5周龄的雄性SPF级SD大鼠,按随机数字法分为模型组(Model)、索拉非尼组(Sorafenib)、地五养肝治疗组(DWYG)、细胞对照组(BMSC)、空白对照组(Normal),每组16只。室内清洁消毒后,加饲料及水适应性饲养1周后开始造模,用Solt-Farber二步法建立肝癌大鼠模型,具体方法如下:即造模第一天,模型组、索拉非尼组、地五养肝治疗组按50mg/kg的剂量一次性腹腔注射(Intraperitoneal,ip)二乙基亚硝胺(Diethylmitrosamine,DEN)作为启动剂,2周后均按15mg/kg/d剂量予以二乙酰氨基芴(2-Acetylaminofluorene,2-AAF)灌胃(Intragastrical administration,ig)7天,第3周末行2/3肝部分切除术(Partial hepatectomy,PHx),切除肝左叶和中叶,并将红色荧光蛋白标记的骨髓干细胞(Red fluorescent protein-bone stem cells,RFP-BMSCs)种植于大鼠肝右叶的12点、3点、6点、9点和中心点位置,每个点注射0.1ml RFP-BMSCs(约105个细胞),分层缝合。细胞对照组不做肝切除术仅移植RFP-BMSCs于大鼠肝右叶。地五养肝治疗组于造模期间按750mg/kg/d剂量给予地五养肝胶囊水溶液(DWYG)灌胃,索拉非尼组按80mg/kg/d剂量给予索拉非尼溶液(Sorafenib)灌胃,模型组、细胞对照组、空白对照组则给予等量生理盐水(Normal saline)灌胃对照。手术4天起给予对应的药物灌胃16周。即模型组(DEN ip+2-AAF ig+PHx+RFP-BMSCs+NS ig)、索拉非尼组(DEN ip+2-AAF ig+PHx+RFP-BMSCs+Sorafenib ig)、地五养肝治疗组(DEN ip+2-AAF ig+PHx+RFP-BMSCs+DWYG ig)、细胞对照组(NS ip+RFP-BMSCs+NS ig)、空白对照组(NS ip+NS ig)。实验结束后处死各组实验大鼠,切取实验大鼠肝组织以4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,做厚5μm的连续切片,苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining,he)进行组织病理学检测,并于每组内每张切片随机挑选3-4个400倍视野,采用记分法进行半定量分析评估每个视野中肝癌的病理程度。根据edmondson-steiner分级标准和阳性细胞百分比分别计分,以各组平均积分分析不同组中大鼠肝癌病理程度。切取实验大鼠肝组织以carnoy’s固定液固定(无水乙醇:冰乙酸=3:l)做厚5μm的连续切片,feulgen染色进行肝细胞核dna含量检测。免疫组织化学染色法以检测肝组织pcna、abcg2、cd34、thy-1的表达。采用免疫荧光法检测肝组织中骨髓干细胞和肝癌干细胞相关标志物abcg2/cd34、abcg2/cd45、abcg2/thy-1的表达。切取大鼠肝组织以液氮冻存。蛋白印迹杂交技术(westernblot)检测肝组织中emt相关e-cadherin、vimentin、tgf-β1的表达,检测ras/raf/mek/erk、jak/stat信号通路相关蛋白的表达。逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,rt-pcr)检测e-cadherin、vimentin、ras/raf/mek/erk、jak/stat信号通路相关mrna的表达。所有数据均采用spss19.0统计软件进行统计学处理,结果均以mean±sd(均数土标准差)表示。多组之间比较采用单因素方差分析(one-wayanova),p<0.05被认为有统计学意义。结果:1肉眼观察肝脏大体形态:空白对照组肝脏形态正常,表面光滑,边缘锐利,质软。模型组和空白对照组比较,可见肝脏形态不规则,肝叶不全,表面粗糙,凸凹不平,质地较硬,表面和切面呈弥漫性肝结节,大小不等,或可见出血、坏死等特征。经索拉非尼、地五养肝胶囊治疗后上述病理表现明显减轻。2组织病理学结果(he染色):空白对照组肝细胞结构基本正常,排列整齐,胞膜完整,胞核清晰。模型组和空白对照组比较,可见肿瘤细胞生长旺盛,细胞密度大,肝细胞索排列紊乱,核质比大,核染色深,或核异型,伴炎性细胞浸润等病理特征。和模型组比较,经索拉非尼、地五养肝胶囊治疗后上述病理变化明显减轻。细胞对照组部分可见炎性细胞小灶。采用记分法半定量分析各组大鼠肝癌病理程度,结果显示:模型组的平均积分(10.90±2.71)明显高于空白对照组(0.00±0.00),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组的平均积分(8.00±2.43)低于模型组(10.90±2.71),差异有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组的平均积分(8.20±3.11)亦低于模型组(10.90±2.71),具有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(8.00±2.43)和索拉非尼组(8.20±3.11)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。3地五养肝胶囊对肝细胞核dna含量的影响(feulgen染色法):模型组(14297.24±620.84)iod值明显高于空白对照组(2901.33±84.64),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(8554.73±135.86)iod值低于模型组(14297.24±620.84),具有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组(8965.99±338.65)iod值亦低于模型组(14297.24±620.84),p<0.05;地五养肝治疗组(8554.73±135.86)iod值低于索拉非尼组(8965.99±338.65),差异有统计学意义(p<0.05);空白对照组(2901.33±84.64)和细胞对照组(3346.42±181.37)比较,无统计学意义(p>0.05)。4地五养肝胶囊对pcna(proliferatingcellnuclearantigen,增殖细胞核抗原)表达的影响(免疫组织化学法):模型组(0.5790±0.0303)od值明显高于空白对照组(0.2821±0.0138),差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.4397±0.0181)od值明显低于模型组(0.5790±0.0303),具有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组(0.4553±0.0208)pcna的表达亦低于模型组(0.5790±0.0303),p<0.05;地五养肝治疗组(0.4397±0.0181)和索拉非尼组(0.4553±0.0208)之间,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.2821±0.0138)和细胞对照组(0.2934±0.0223)比较,无统计学意义(p>0.05)。5地五养肝胶囊对肝癌干细胞的影响(1)地五养肝胶囊对骨髓干细胞和肝癌干细胞相关标志物abcg2、cd34、thy-1双阳性表达的影响(免疫组织化学法):免疫组织化学染色对abcg2表达的检测结果显示:模型组abcg2的表达(0.3276±0.0210)明显高于空白对照组(0.1930±0.0045),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.2423±0.0144)od值明显低于模型组(0.3276±0.0210),具有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组(0.2514±0.0203)abcg2的表达亦低于模型组(0.3276±0.0210),p<0.05;地五养肝治疗组(0.2423±0.0144)和索拉非尼组(0.2514±0.0203)之间,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.1930±0.0045)和细胞对照组(0.1964±0.0126)比较,无统计学意义(p>0.05)。免疫组织化学染色对cd34表达的检测结果显示:模型组cd34的表达(0.5880±0.0290)明显高于空白对照组(0.4077±0.0086),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.4857±0.0312)od值明显低于模型组(0.5880±0.0290),具有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组(0.4648±0.0239)cd34的表达亦低于模型组(0.5880±0.0290),p<0.05;地五养肝治疗组(0.4857±0.0312)和索拉非尼组(0.4648±0.0239)之间,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.4077±0.0086)和细胞对照组(0.3980±0.0098)比较,无统计学意义(p>0.05)。免疫组织化学染色对thy-1表达的检测结果显示:模型组thy-1的表达(0.5887±0.0361)明显高于空白对照组(0.4121±0.0134),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.4787±0.0228)od值明显低于模型组(0.5887±0.0361),具有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组(0.4790±0.0274)thy-1的表达亦低于模型组(0.5887±0.0361),p<0.05;地五养肝治疗组(0.4787±0.0228)和索拉非尼组(0.4790±0.0274)之间,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.4121±0.0134)和细胞对照组(0.4085±0.0220)比较,无统计学意义(p>0.05)。(2)地五养肝胶囊对骨髓干细胞及肝癌干细胞相关标志物双阳性表达的影响(免疫荧光法):模型组、索拉非尼组和地五养肝治疗组中abcg2/cd34、abcg2/cd45、abcg2/thy-1呈双阳性表达。模型组abcg2/cd34的双阳性荧光表达(0.3136±0.0294)明显高于空白对照组(0.1954±0.0110),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.2188±0.0114)abcg2/cd34的双阳性表达明显低于模型组(0.3136±0.0294),具有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组(0.2359±0.0179)abcg2/cd34的双阳性表达亦低于模型组(0.3136±0.0294),p<0.05;地五养肝治疗组(0.2188±0.0114)和索拉非尼组(0.2359±0.0179)比较,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.1954±0.0110)和细胞对照组(0.1944±0.0066)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。模型组abcg2/cd45的双阳性荧光表达(0.3089±0.0113)明显高于空白对照组(0.1996±0.0104),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.2377±0.0163)abcg2/cd45的双阳性表达明显低于模型组(0.3089±0.0113),具有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组(0.2328±0.0157)abcg2/cd34的双阳性表达亦低于模型组(0.3089±0.0113),p<0.05;地五养肝治疗组(0.2377±0.0163)和索拉非尼组(0.2328±0.0157)之间,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.1996±0.0104)和细胞对照组(0.1891±0.0090)比较,无统计学意义(p>0.05)。模型组abcg2/thy-1的双阳性荧光表达(0.2953±0.0146)明显高于空白对照组(0.1995±0.0082),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.2320±0.0148)abcg2/thy-1的双阳性表达明显低于模型组(0.2953±0.0146),具有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组(0.2458±0.01360)abcg2/cd34的双阳性表达亦低于模型组(0.2953±0.0146),p<0.05;地五养肝治疗组(0.2320±0.0148)和索拉非尼组(0.2458±0.01360)之间,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.1995±0.0082)和细胞对照组(0.1980±0.0076)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。6地五养肝胶囊对肝癌发生发展的机制相关指标的影响(1)地五养肝胶囊对emt相关指标的影响:westernblot检测emt相关标志物结果显示:模型组(0.35±0.03)的上皮细胞标志物e-cadherin蛋白表达明显低于空白对照组(1.16±0.10),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.72±0.04)e-cadherin蛋白表达明显高于模型组(0.35±0.03),具有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.72±0.04)和索拉非尼组(0.62±0.07)比较,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(1.16±0.10)和细胞对照组(1.22±0.09)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。模型组间皮细胞标志物vimentin蛋白的表达(1.52±0.06)明显高于空白对照组(0.36±0.03),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.93±0.08)vimentin蛋白的表达明显低于模型组(1.52±0.06),具有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.93±0.08)和索拉非尼组(1.08±0.11)比较,差异有统计学意义(p<0.05);空白对照组(0.36±0.03)和细胞对照组(0.33±0.01)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。模型组中对emt起重要调节作用的tgf-β1蛋白的表达(1.76±0.10)明显高于空白对照组(0.43±0.04),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.93±0.05)tgf-β1蛋白的表达明显低于模型组(1.76±0.10),具有统计学意义(p<0.05);细胞对照组(0.30±0.03)和空白对照组(0.43±0.04)比较,有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.93±0.05)和索拉非尼组(0.93±0.03)相比,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.43±0.04)和细胞对照组(0.30±0.03)比较,差异有统计学意义(p<0.05)。rt-pcr结果显示:模型组的上皮细胞标志物e-cadherinmrna表达明显低于空白对照组,经统计学处理,差异显著(p<0.05);地五养肝治疗组e-cadherinmrna的表达明显高于模型组,差异有统计学意义(p<0.05);而间皮细胞标志物vimentinmrna表达明显高于空白对照组,经统计学处理,p<0.05;地五养肝治疗组vimentinmrna的表达明显低于模型组,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组e-cadherin和vimentinmrna的表达与索拉非尼组比较,差异无统计学意义p>0.05;空白对照组和细胞对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。(2)地五养肝胶囊对ras/raf/mek/erk通路相关指标的影响:westernblot结果显示模型组raf-1(0.91±0.05)蛋白的表达明显高于空白对照组(0.40±0.05),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.79±0.02)raf-1、蛋白表达明显低于模型组(0.91±0.05),具有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.79±0.02)raf-1蛋白的表达与索拉非尼组(0.77±0.05)比较,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.40±0.05)和细胞对照组(0.36±0.04)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。mek1(1.81±0.10)蛋白的表达明显高于空白对照组(0.70±0.03),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(1.10±0.05)mek1蛋白表达明显低于模型组(1.81±0.10),具有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组mek1蛋白(1.10±0.05)的表达低于索拉非尼组(1.25±0.05),p<0.05;空白对照组(0.70±0.03)和细胞对照组(0.72±0.06)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。erk1(1.49±0.04)蛋白的表达明显高于空白对照组(0.55±0.11),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.95±0.09)erk1蛋白表达明显低于模型组(1.49±0.04),具有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(0.95±0.09)erk1蛋白的表达与索拉非尼组(0.98±0.08)比较,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.55±0.11)和细胞对照组(0.53±0.12)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。模型组vegf(2.31±0.15)蛋白的表达明显高于空白对照组(0.59±0.05),经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(1.76±0.24)vegf蛋白表达明显低于模型组(2.31±0.15),具有统计学意义(p<0.05);地五养肝治疗组(1.76±0.24)vegf蛋白的表达与索拉非尼组(1.66±0.13)比较,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.59±0.05)和细胞对照组(0.77±0.07)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。rt-pcr结果显示:模型组raf-1、mek1、erk1mrna的表达明显高于空白对照组,经统计学处理,p<0.05;与模型组比较,地五养肝治疗组中raf-1、mek1、erk1mrna的表达均降低,差异有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组raf-1、mek1、erk1mrna表达亦低于模型组,p<0.05;地五养肝治疗组与索拉非尼组比较,差异无统计学意义;空白对照组和细胞对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。(3)地五养肝胶囊对jak/stat通路相关指标的影响:模型组(1.40±0.04)jak2蛋白的表达明显高于空白对照组(0.47±0.03),经统计学处理,p<0.05。地五养肝治疗组jak2的表达(1.01±0.05)显著下调,与模型组(1.40±0.04)比较,差异有统计学意义,p<0.05;地五养肝治疗组(1.01±0.05)jak2蛋白的表达与索拉非尼组(1.12±0.09)比较,差异有统计学意义(p<0.05);空白对照组(0.47±0.03)和细胞对照组(0.49±0.04)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。模型组(1.27±0.09)stat3蛋白的表达明显高于空白对照组(0.44±0.06),经统计学处理,p<0.05;地五养肝治疗组stat3的表达(0.85±0.03)显著下调,与模型组(1.27±0.09)比较,差异有统计学意义,p<0.05;地五养肝治疗组(0.85±0.03)stat3蛋白的表达与索拉非尼组(0.96±0.08)比较,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.44±0.06)和细胞对照组(0.40±0.09)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。模型组(1.58±0.04)stat5蛋白的表达明显高于空白对照组(0.63±0.04),经统计学处理,p<0.05;地五养肝治疗组stat5的表达(0.95±0.09)显著下调,与模型组(1.58±0.04)比较,差异有统计学意义,p<0.05;地五养肝治疗组(0.95±0.09)stat5蛋白的表达与索拉非尼组(1.10±0.15)比较,差异无统计学意义(p>0.05);空白对照组(0.63±0.04)和细胞对照组(0.62±0.05)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。rt-pcr结果显示:模型组jak2、stat3的mrna表达明显高于空白对照组,差异有统计学意义,p<0.05;地五养肝治疗组jak2、stat3的表达显著下调,与模型组比较,差异有统计学意义(p<0.05);索拉非尼组jak2、stat3mrna表达亦低于模型组,p<0.05;地五养肝治疗组jak2mrna表达低于索拉非尼组,差异有统计学意义(p<0.05);空白对照组和细胞对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。结论:1地五养肝胶囊在一定程度上抑制了solt-farber二步法肝癌大鼠模型的肝癌发生发展,其效果不低于索拉非尼。2骨髓干细胞转化肝癌干细胞参与肝癌发生发展是“髓失生肝”的生物学基础。骨髓干细胞转化肝干细胞参与肝再生修复是“髓生肝”的生物学基础。体现“补肾生髓成肝”治疗法则的地五养肝胶囊具有抑制“髓失生肝”、促进“髓生肝”的作用。该研究丰富了“髓失生肝/髓生肝”的科学内涵。3体现“补肾生髓成肝”治疗法则的地五养肝胶囊通过改善肝再生的微环境从而延缓肝癌发生发展的进程,其可能作用机制如下:(1)抑制“髓失生肝”、促进“髓生肝”;(2)通过调控emt/met失衡,抑制emt,促进met;(3)通过调节jak/stat信号通路;(4)通过调节ras/raf/mek/erk信号通路。