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第一部分大鼠原位肝移植模型手术改进目的:建立大鼠原位肝移植(Rat orthotopic liver transplantation,ROLT)模型对供肝质量的评价与研究至关重要。传统的显微缝合重建管道方法耗时较长,且对吻合技术要求过高,不利于推广。Kamada二袖套法及其改良法的出现使该模型简化并趋于稳定。笔者基于此方法,针对手术中潜在危险因素和细节问题的处理进行了探讨,并且对整个ROLT术中影响大鼠术后生存率的危险因素进行分析,对肝上下腔静脉吻合(suprahepatic inferior vena cava,SHVC)技术进行改进,以期获得稳定的大鼠术后生存率。方法:雄性SPF级SD大鼠180只,体重250±20 g。实验分为三组,第一组:ROLT模型学习阶段(60只);第二组:ROLT模型稳定阶段(60只);第三组:ROLT模型改良阶段(60只)。在受体手术过程中,记录各个部分操作用时,包括:无肝期,肝上下腔静脉、门静脉、肝下下腔静脉及胆管的重建时间等,同时记录手术成功率。术后每天观察受体的一般状况,对术中及术后死亡的大鼠及时进行尸检。统计并比较移植术后1天及7天生存率。结果:本研究共实施大鼠原位肝移植手术90例。三个阶段无肝期相比较,第二阶段比第一阶段缩短40%,第三阶段比第一阶段缩短64%。三个阶段肝移植术后24小时存活率分别为:20%(6/30);86.7%(26/30);100%(30/30)。三个阶段大鼠肝移植术后一周存活率分别为 10%(3/30),60%(18/30)及 93%(28/30)。结论:ROLT术后生存率的提升须注意对术中各细节的处理。无肝期过程中,需快速、熟练地完成SHVC的吻合。尤其是缩短无肝期可提高手术安全性,而缩短无肝期决定于手术熟练度,技术稳定性,特别是针对大鼠无肝期内环境和血液动力学改变采取有效的处理措施,可有效减少术中危险因素,提高围手术期和术后生存率,并为进一步实验奠定坚实的基础。第二部分大鼠低温携氧机械灌注系统的建立及其参数探讨目的:本研究通过比较并评估低温携氧机械灌注(Hypothermic oxygenated machine perfusion,HOPE)过程中不同压力参数下肝脏质量的变化,建立一种稳定、安全、有效的HOPE系统,实现对肝脏的精细化灌注,以达到修复和优化肝脏质量的目的,为临床研究提供思路,从而达到扩大供肝来源的目的。方法:雄性SPF级SD大鼠(220±10g)30只,根据不同的门静脉灌注压力分随机分为 5 组(n=6),A 组:OmmHg,B 组:2mmHg,C 组:4mmHg,D 组:6mmHg及E组:8mmHg。肝脏获取后经离体冷保存(A组)或HOPE(B组、C组、D组及E组)干预3小时后,观察并记录各组肝脏湿重变化,检测灌注液中ALT、AST及LDH的含量与肝组织中MDA、糖原、乳酸盐含量以评估肝脏质量。结果:随着肝脏门静脉灌注压力的升高,各组肝脏湿重均有不同程度增加,D组及E组增加最为明显,最高达40%。同时,灌注液中ALT、AST、LDH,肝脏组织中的MDA及乳酸盐的含量随着门静脉灌注压力的升高逐渐增加,而C组肝脏中糖原含量最低,E组含量最高。结论:严格调控HOPE期间的灌注参数,将灌注压力控制在4mmHg以内,能够保证肝脏充分灌注的同时尽可能地降低灌注性损伤,从而达到修复和优化肝脏质量的目的,为临床应用提供理论依据。第三部分大鼠脂肪供肝模型的建立目的:本研究旨在建立一种稳定的大鼠脂肪供肝模型,模拟人体发病机制,为优化边缘供肝的研究奠定基础。方法:成年SPF级SD大鼠90只,雄性,体重220±10g。随机选取10只大鼠经过适应性喂养一周后取材,检测指标作为正常对照。其余80只分为两组,A组:高脂饮食组(High-fat diet,HFD)(n=40),采取60%高脂饮食(60%脂肪,20.6%碳水化合物,19.4%蛋白。其中脂质部分包含90%猪油及10%大豆油)饲养;B组:普通饮食组(Standard chow diet,SCD)(n=40),采用普通低脂饮食饲养,饮食诱导持续8周。造模期间观察大鼠生命体征及一般情况,每周检测其组织学及血清学变化情况。结果:与SCD组相比,HFD组血清中ALT和AST水平均无统计学差异。HFD组血清TG水平在第1、2周上升较快,达到正常值的两倍以上,在随后的第3-8周内逐渐降至正常值。HFD组血糖、胰岛素及肝组织脂质含量与SCD组比较有明显统计学差异(P<0.05,P<0.05和P<0.01)。各组脂肪肝中MDA含量无明显差异(P>0.05)。随着造模时间延长,肝脏脂肪变性程度逐渐加重,第1-3周以小泡型脂肪变性为主,第4-8周则以大泡型脂肪变性为主。结论:选择不同造模时间来诱导实验所需程度的大鼠肝脏脂肪变性,本组脂肪供肝的模型验证了该配方的有效性及稳定性,并为进一步实验提供可靠稳定的大鼠脂肪供肝模型。第四部分低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其机制目的:器官供需严重失衡,脂肪供肝质量的优化可提高使用率,有益于扩大供体器官的来源。本研究拟分析静态冷保存(Static Cold storage,SCS)与低温携氧机械灌注(Hypothemic oxygenated machine perfusion,HOPE)对脂肪肝的作用,进一步探讨 HOPE对于脂肪供肝的质量优化作用及其潜在机制。方法:成年SPF级SD大鼠44只,雄性,体重220±10g,采用普通饲料(A组)或60%高脂饲料(B-D组)进行饲养。分为4组:A组(11只):非脂肪变性肝脏获取后,置于UW液(0-4℃)中保存45分钟(修肝)后移植。B组(11只):脂肪变性肝脏获取后在0-4℃的保存液中4小时后移植。C组(11只):脂肪变性肝脏获取后经历3小时HOPE以及1小时CS后移植。D组(11只):脂肪变性肝脏获取后经历3小时HOPE+1小时CS(灌注液中增加脱脂药)后移植。通过记录肝脏灌注过程中的参数,Western blot 检测肝脏组织中 KLF-2、eNOS、ICAM-1、HMGB1、TLR4、PRDX6、Caspase-3、PP2A、PPY、GRP78、CHOP 与 ATF-6 蛋白表达水平,Tunel 检测各组中肝细胞凋亡情况,试剂盒检测肝脏组织中ATP与肝糖原含量,比较各组移植术后生存率,综合评价肝脏质量。结果:比较门静脉开放1min后各组肝脏复灌情况,结果显示A组脂肪供肝复灌效果最佳,B组效果最差;与B组相比,C组与D组微循环相关蛋白KLF2及eNOS表达明显升高,同时D组表达最高,且差别有统计学意义(P<0.05),而ICAM-1蛋白水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);HMGB1与TLR4在C组与D组的表达水平明显下降,B组中表达量最高,而PRDX6在B组中明显降低,三者差别均有统计学意义(P<0.05),表明经HOPE与DF干预之后的脂肪供肝炎症损伤明显减轻,抗氧化损伤能力明显增强;C组与D组内质网应激相关蛋白PPY、GRP78、CHOP、ATF-6表达较B组呈下降趋势,其中D组表达最低,反之C组与D组中PP2A表达升高,B组表达最低,三者差异有统计学意义(P<0.05),同时Tunel结果证实:与B组相比,C组与D组肝细胞凋亡得到明显抑制。移植术后24小时肝脏组织中ATP与糖原含量结果显示,B组中ATP含量较低,而C与D组中ATP含量明显升高,反之,肝糖原含量在B组中较高,三者差异有统计学差异(P<0.05);比较各组移植术后生存曲线发现,C组与D组移植术后生存率较B组明显升高。结论:低温携氧机械灌注通过改善脂肪供肝微循环,抑制内质网应激,稳定线粒体功能促进ATP合成,清除炎症因子等减轻缺血再灌注损伤,从而提高移植术后受者生存率,为临床应用HOPE提供了理论依据。脱脂药在低温状态下无法促进脂肪供肝的脂质分解,但可以进一步改善微循环、抑制炎症因子的释放等,从而优化肝脏质量。为脂肪肝应用于移植提供理论依据。