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复合树脂及粘接系统广泛应用于修复牙体组织缺损,改善牙齿颜色和外观。但因缺乏有效的抗菌性能,复合树脂材料表面容易聚积菌斑;树脂材料的聚合收缩和粘接不良可形成界面微渗漏,成为致龋菌的侵入通道。因此,继发龋常影响树脂修复体远期临床效果,是修复失败的重要原因。目前,开发具有抗菌功能的复合树脂和粘接系统受到了国内外学者的广泛关注,希望借此减少继发龋的发生。有研究将抗菌剂添加至树脂基质,依赖抗菌剂的释放获得抗菌功能。但抗菌成分的添加和释放会影响材料的力学性能和美学效果,且获得的抗菌性能难以稳定持久。为克服上述抗菌改性方式的不足,研究者尝试开发可聚合抗菌单体用于树脂材料抗菌改性,将抗菌功能基团接枝共聚于树脂基质,发挥稳定的接触性抗菌作用,且无损材料的机械性能,具有良好的应用前景。据此,本课题组合成了多种可聚合季铵盐抗菌功能单体,其中甲基丙烯酰氧乙基一正十六烷基一二甲基氯化铵(methacryloxylethyl cetyl dimethyl ammonium chloride,DMAE-CB),对口腔常见细菌具有较强的杀菌作用,因此作为备选单体用于树脂材料抗菌改性。评价修复材料抗菌效果的研究多局限于应用琼脂平板弥散法对抑菌环的观察,材料浸提液对细菌悬液的作用,以及材料对浮游状态细菌生长的影响等。上述实验均可用于检测材料的溶出性抗菌性能,但无法准确评价含有季铵盐抗菌单体的高分子牙科材料的接触性抗菌性能。此外,实验中采用浮游状态细菌进行抗菌研究,同口腔环境中的菌斑生物膜相差甚远。细菌在形成菌斑生物膜后,基因表达和生物学行为发生改变,耐药性显著提高。因此,体外培养生物膜,研究抗菌材料表面对生物膜形成和生态特征的影响,对于准确评估材料的临床应用前景尤为重要。1主要研究目的:将季铵盐抗菌单体DMAE-CB添加到商品化牙本质粘接剂Single Bond 2中,获得改性粘接剂作为实验组,并以Single Bond 2作为阴性对照,含有抗菌单体MDPB的粘接系统Clearfil Protect Bond作为阳性对照。评价DMAE-CB改性牙本质粘接剂固化后的抗菌效果,及其对菌斑生物膜形成和活性的影响,初步探索固定于高分子网络的季铵盐基团抑制细菌生长和生物膜形成的机理。2主要研究方法:2.1采用接触抑菌实验评价改性粘接剂的固化表面对变形链球菌生长的影响。2.2研究老化处理和唾液处理对改性粘接剂固化表面抗菌性能的影响。2.3分析变形链球菌在粘接剂浸提液中的生长动力学和倍增时间,检测材料浸提液的抗菌活性。2.4利用荧光指示剂和激光共聚焦扫描显微镜评价改性粘接剂固化表面对变形链球菌胞膜完整性的影响,初步探索固定于高分子网络的季铵盐基团的抗菌机理。2.5改性粘接剂固化表面进行变链生物膜和全菌生物膜的体外培养,通过光密度值评价改性材料对变链生物膜和全菌生物膜形成的影响。2.6采用光密度值分析,评价改性粘接剂的固化表面经老化处理后对体外变链生物膜和全菌生物膜形成的影响。2.7扫描电镜观察改性粘接剂表面变链生物膜和全菌生物膜初步形成和成熟过程,验证改性材料对生物膜形成的影响。2.8应用荧光指示剂和激光共聚焦扫描显微镜研究改性材料表面变链生物膜和全菌生物膜的三维活性结构。2.9改性材料表面培养变链生物膜,收集生物膜变链和孵育液中浮游变链,进行RNA抽提和实时定量RT-PCR分析,检测改性材料表面生物膜变链和孵育液中浮游变链的gtf基因表达水平,初步探索固定于高分子网络的季铵盐基团抑制生物膜形成的机理。3主要研究结果:3.1固化后的DMAE-CB改性粘接剂可抑制表面变形链球菌的生长,生长抑制率约为99%(P < 0.05)。3.2老化处理或唾液处理后,改性材料表面仍表现出抗菌活性:细菌生长抑制率分别约为99% (P < 0.05)和90% (P < 0.05)。3.3改性粘接剂的浸提液无抗菌活性:实验组和阴性对照组浸提液中变形链球菌指数生长期拟合直线的斜率及细菌的倍增时间均无显著差异(P > 0.05)。3.4荧光染色标记后,细胞膜完整的细菌染为绿色,胞膜受损的细菌染为红色。阴性对照粘接剂固化表面细菌密集;改性粘接剂和阳性对照粘接剂表面细菌附着较少。3.5荧光强度分析显示各组的总荧光强度FIt和红绿荧光强度比值FIr/FIg的差异显著(P < 0.05);阴性对照组的FIt值最高而FIr/FIg最低(P < 0.05),提示改性粘接剂组和阳性对照可以损伤变形链球菌胞膜的完整性,减少细菌粘附。3.6同阴性对照相比,改性粘接剂和阳性对照组的固化表面可抑制表面变链生物膜和全菌生物膜的形成(P < 0.05)。3.7老化处理后改性材料和阳性对照的表面,变链生物膜和全菌生物膜形成量较老化前均无显著提高(P > 0.05),仍表现出抑制表面生物膜形成的作用(P < 0.05)。3.8扫描电镜观察发现:改性粘接剂表面变链生物膜孵育4 h,可见变链和细胞外基质散在分布;孵育24 h,形成松散的变链生物膜。改性粘接剂表面的全菌生物膜孵育4 h,可见细菌残骸;孵育24 h后,形成全菌生物膜。3.9改性粘接剂表面的变链生物膜和全菌生物膜的厚度和总体活性均较阴性对照组下降。3.10粘接剂表面生物膜变链的gtfBCD基因表达,三组之间有所差异:阳性对照组和改性粘接剂组的生物膜变链gtfB表达分别下降为阴性对照的23%和8.6% (P < 0.05),gtfC的表达分别下降为阴性对照的35.9 %和14.1 % (P < 0.05);而阳性对照组和改性粘接剂组gtfD的表达同阴性对照之间没有显著差异(P > 0.05)。3.11试件孵育液中的浮游态细菌的gtfB、gtfC和gtfD的RNA拷贝数,三组之间均无显著差异(P > 0.05)。4主要结论:4.1 DMAE-CB改性粘接剂固化后可以抑制表面细菌生长和粘附。4.2老化处理后DMAE-CB改性材料仍表现出抗菌活性,提示季铵盐单体改性牙本质粘接剂可以长期发挥抗菌作用。4.3唾液预处理后DMAE-CB改性材料仍表现出抗菌活性,提示季铵盐单体改性粘接剂可在口腔环境中发挥抗菌作用,具有临床应用前景。4.4排除了抗菌单体从改性粘接剂固化样本中溶出发挥抗菌作用的可能,明确了DMAE-CB改性粘接剂固化后具有接触性抗菌性能。4.5 DMAE-CB改性粘接剂可以影响所接触细菌的胞膜完整性,由此部分解释固定于树脂基质中阳离子抗菌基团的抗菌机制。4.6 DMAE-CB改性粘接剂和含有抗菌单体MDPB的阳性对照粘接剂的固化表面可以抑制变形链球菌生物膜和全菌生物膜的形成。4.7老化处理后,DMAE-CB改性粘接剂和阳性对照的固化表面对变形链球菌生物膜和全菌生物膜形成的抑制作用无明显衰减。4.8 DMAE-CB改性粘接剂表面可下调变链生物膜和全菌生物膜的活性。4.9 DMAE-CB改性粘接剂和阳性对照的固化表面可以选择性下调生物膜变链的gtf基因表达,由此部分解释固定于树脂基质中阳离子抗菌基团抑制变链生物膜形成的机制。4.10抗菌单体改性材料表面对gtf基因表达的影响局限于材料表面的变链生物膜,排除了抗菌单体从粘接样本中溶出发挥抗菌作用的可能,明确了DMAE-CB改性粘接剂具有接触性抗菌性能。综上,可聚合季铵盐抗菌单体DMAE-CB可以用于牙本质粘接剂抗菌改性,改性材料固化后,阳离子抗菌基团固定于树脂基质网络,影响变形链球菌生长、粘附、胞膜完整性,以及影响生物膜的形成和活性,选择性下调变形链球菌gtf基因表达水平,发挥抗菌、抑制生物膜形成的作用,赋予粘接剂持久稳定的接触性抗菌活性。