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间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），是一种来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于器官间质和结缔组织中，以骨髓中含量最为丰富。大量研究表明，损伤或病变部位可以通过分泌各种趋化因子，如HGF、PDGF、VEGF、SDF-1α等，诱导 MSCs向病灶部位迁移。体内研究表明成功迁移至损伤或病变部位的细胞数极少，修复和治疗效果非常有限。因此提高 MSCs的定向迁移能力，增加迁移到损伤或病变部位的移植细胞数量对改善疗效至关重要。 MicroRNAs（miRNAs）是一类在进化上保守的长约20-24 nt的非编码单链小RNA，通过与信使RNA（mRNA）的3’非翻译区（3’untranslated regions,3’UTRs）相结合，导致mRNA降解或者靶基因的翻译被抑制，从而在转录后水平调控基因的表达。随着对miRNAs研究的深入，越来越多的研究表明miRNAs对MSCs的增殖、分化、凋亡等具有重要的调控作用，也有研究显示某些 miRNAs表达的改变影响细胞迁移。 本实验室前期工作发现HGF能够促进MSCs的趋化迁移，不同分化状态MSCs向HGF的迁移能力不同，miR-26b促进MSCs向HGF的趋化迁移。本文将围绕miR-26b与不同分化状态MSCs趋化迁移间的关系进行研究。我们首先以RT-qPCR检测不同分化状态MSCs中miR-26b的表达，结果显示，miR-26b在不同分化状态MSCs中表达存在差异。HGF处理不同分化状态MSCs5 h后，miR-26b的表达量显著提高，其中未分化状态和预诱导24 h的MSCs中miR-26b的表达上调幅度较大，提示miR-26b可能与不同分化状态MSCs趋化应答有关。Boyden chamber实验发现，高表达miR-26b显著促进未分化、预诱导24 h以及诱导5 h MSCs趋化迁移，而对维持18 h MSCs趋化迁移影响不显著；抑制miR-26b显著降低了不同分化状态MSCs趋化迁移。Dunn chamber实验发现，miR-26b能够显著增强未分化及预诱导24 h细胞迁移的平均速率，而对诱导5 h及维持18 h细胞迁移的平均速率影响不显著，miR-26b对不同分化状态细胞迁移的效率无显著影响。以上实验表明，miR-26b参与调控不同分化状态MSCs趋化迁移。 PTEN的脂质磷酸酶活性导致PIP3去磷酸化生成PIP2，导致PI3K对Akt的磷酸化作用被阻断，负调控PI3K/Akt信号通路。前期研究发现，在MSCs中，高表达miR-26b后PTEN的mRNA和蛋白水平均被下调。为了验证PTEN与miR-26b的相互关系，我们构建了 PTEN重组腺病毒载体，回复实验进一步证实 miR-26b靶向PTEN，促进MSCs趋化迁移。进一步研究发现，高表达miR-26b显著提高不同分化状态MSCs中Akt磷酸化水平，而抑制miR-26b显著降低Akt磷酸化水平。改变 miR-26b的表达不影响不同分化状态 MSCs中 SAPK/JNK、ERK1/2及p38MAPK磷酸化水平。以 PI3K/Akt抑制剂 LY294002处理不同分化状态 MSCs后，显著抑制了高表达miR-26b的MSCs的迁移。以上结果表明PI3K/Akt信号通路参与调控miR-26b介导的不同分化状态MSCs趋化迁移，而MAPKs信号通路不参与此过程。MiR-26b通过活化Akt促进不同分化状态MSCs趋化迁移，但高表达miR-26b部分回复了LY294002所抑制的细胞趋化迁移，提示其它信号通路可能也参与miR-26b对MSCs迁移的调控。 细胞的定向迁移或趋化迁移需要细胞极化及迁移相关信号分子在细胞前端活化，从而调控细胞骨架的重排、伪足的形成和黏着斑的组装与解聚，保证细胞前缘稳定及迁移方向的持续性。随后，胞体后端黏着斑解聚，应力纤维收缩，胞体尾部回缩，细胞向前端迁移。因此我们通过免疫荧光染色实验检测miR-26b对MSCs中黏着斑的数量、分布以及细胞骨架重排的影响，发现高表达 miR-26b促进细胞单个片状伪足及细胞极性的形成，且促进细小黏着斑的形成及其向细胞周边的分布。 我们发现同时高表达Ad-26b和Ad-PTEN与Ad-PTEN组相比，细胞向HGF的趋化迁移显著增强，说明 miR-26b除了靶向PTEN调控细胞迁移之外，也可能通过其它靶基因调控细胞的迁移。我们通过 TargetScan、miRDB等软件分析发现GSK-3β、ROCK1的3’UTR区有miR-26b的结合位点，RT-qPCR结果显示，高表达miR-26b显著下调GSK-3β、ROCK1的mRNA表达量，提示miR-26b可能靶向GSK-3β、ROCK1。进一步，我们采用ROCKs的抑制剂Y27632处理MSCs后，通过免疫荧光染色观察细胞形态的变化。结果显示，Y27632处理后细胞极性显著增强，而细胞面积变化不显著，细胞末端更易于形成片状伪足。这与高表达miR-26b促进细胞极化和片状伪足形成等结果一致，提示ROCKs及其下游通路可能参与介导miR-26b对MSCs迁移的调控作用，其具体机制还需进一步研究。 综上所述，miR-26b通过靶向PTEN调节PI3K/Akt信号通路促进不同分化状态MSCs趋化迁移。miR-26b促进细胞片状伪足的形成，促进细胞前缘细小的新生黏着斑形成及其向细胞周边的分布。 本实验阐明了miR-26b调控不同分化状态MSCs定向迁移的分子机制，为MSCs的临床应用提供了理论基础。