论文部分内容阅读
目的与意义:支气管哮喘（哮喘）是一种严重危害人类健康的疾病,流行病调查显示其发病率及病死率在世界各地呈上升趋势。目前认为哮喘的病因及发病机制是由遗传基因与环境因素相互作用的结果。环境因素中主要包括吸入物、感染、食物以及一些药物。近年来研究发现病毒感染后哮喘的发病率上升,成人中以鼻病毒常见,儿童中以呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus RSV）最为常见。随着研究的深入,发现单纯的RSV感染不能直接导致哮喘发生,但RSV感染后,患者再次接触过敏原,则可能出现哮喘。因此本实验的目的是通过RSV感染结合OVA雾化吸入建立豚鼠哮喘动物模型,研究RSV诱发哮喘中神经机制的作用。方法:①以Hep-2细胞培养呼吸道合胞病毒,根据细胞病变效应程度和TCID50实验结果选择合适毒力的RSV接种豚鼠。健康、体重250300 g的雌性豚鼠50只,随机分为6组:Hep-2滴鼻（NS）组、RSV滴鼻（RSV）组、Hep-2滴鼻/盐水雾化（Hep-2/NS）组、RSV滴鼻/NS雾化组（RSV/NS组）、Hep-2滴鼻/OVA雾化（Hep-2/OVA）组、RSV滴鼻/OVA雾化（RSV/OVA）组。所有动物在乙醚轻微麻醉下以TCID50=5×10-5.5的RSV悬液250μl或者相同条件的Hep-2细胞培养液滴鼻吸入,第2日以相同剂量加强1次。②第7日,NS组和RSV组的豚鼠,通过二道生理记录仪和电刺激迷走神经法检测并记录两组气道内压力（Intra-airway pressure, IP mmH2O）。然后依次静脉给予0.1、1、10、100μg/kg浓度的选择性M2受体激动剂匹罗卡品,检测IP的变化,根据IP的变化程度评估气道胆碱能神经突触前膜自身抑制性M2受体功能。以10 ml生理盐水进行支气管肺泡灌洗,收集肺泡灌洗液中细胞,常规吉姆萨染色,行细胞分类计数,观察RSV感染对肺脏的炎症影响。以RSV组豚鼠为对照组。③第7日, Hep-2/NS组、RSV/NS组、Hep-2/OVA组和RSV/OVA组豚鼠接受1%OVA或者生理盐水雾化吸入30 min ,隔日1次,持续2 wk,建立哮喘模型。通过肺组织HE染色并计数粘膜与粘膜下细胞总数和嗜酸性粒细胞数目以检验哮喘模型是否成功。④第21日以相同的方法检测气道反应性和M2受体功能,行胆碱能神经纤维免疫组化并计数阳性纤维数目以进一步研究其发病机制。以Hep-2/NS组豚鼠为对照组。结果:①第7日,未刺激迷走神经时,NS组和RSV组豚鼠的IP分别为11.08±1.02 mmH2O和11.75±1.47 mmH2O,差异无统计学意义（P>0.05）。给予电刺激后,两组IP均呈频率依赖性增高,且RSV组明显高于NS组,差异有统计学意义（P<0.05）。依次给予0.1、1、10、100μg/kg浓度的匹罗卡品后,NS组IP呈剂量依赖性降低,而RSV组IP下降幅度明显低于NS组,差异有统计学意义（P<0.05）。支气管肺泡灌洗液的细胞分类计数结果显示RSV组中细胞总数,单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数目均明显高于NS组,差异有统计学意义（均P<0.05）。②第21天,HE染色显示RSV/OVA组豚鼠的肺组织出现明显的炎症细胞浸润,气管收缩,气道分泌物增多等表现,气道粘膜和粘膜下嗜酸性粒细胞数目明显增多,符合哮喘的病理改变。③气道反应性和M2受体功能:未刺激迷走神经时,Hep-2/NS组、RSV/NS组、Hep-2/OVA组和RSV/OVA组的IP分别为10.46±1.55 mmH2O、10.2±1.37 mmH2O、12.11±1.88 mmH2O和16.23±2.28mmH2O,各组间差异无统计学意义（P>0.05）。给予电刺激后,各组IP均呈频率依赖性增高,RSV/NS组与Hep-2/NS组之间差异无统计学意义（P>0.05）,Hep-2/OVA组IP明显高于Hep-2/NS组和RSV/NS组（均P <0.05）, RSV/OVA组IP明显高于Hep-2/OVA组（P<0.05）。依次给予0.1、1、10、100μg/kg浓度的匹罗卡品后,Hep-2/NS组、RSV/NS组和Hep-2/OVA组IP呈剂量依赖性降低,但Hep-2/OVA组IP下降幅度明显低于Hep-2/NS组和RSV/NS组（均P<0.05）。RSV/OVA组IP无明显下降,高于Hep-2/OVA组,差异有统计学意义（P<0.05）。平滑肌层有胆碱能阳性纤维分布:RSV/NS组与Hep-2/NS组之间差异无统计学意义（P>0.05）,Hep-2/OVA组阳性纤维数目明显高于Hep-2/NS组和RSV/NS组（P<0.05）,但RSV/OVA组与Hep-2/OVA组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:①RSV急性感染导致气道副交感神经自身抑制性M2受体功能障碍,引起气道高反应性发生。并引起以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润为主要表现的炎症反应。②RSV感染结合OVA雾化可导致豚鼠肺组织出现哮喘的病理改变。③RSV感染末期气道反应性以及气道M2受体功能恢复正常。但可以促进OVA引起的豚鼠AHR发生,其机制可能是进一步促进OVA雾化吸入导致的气道自身抑制性M2受体功能障碍,从而加剧气道高反应性。OVA可导致气道平滑肌层胆碱能阳性纤维分布增多,但RSV感染对其分布增多无明显影响。