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细胞外ATP(extracellularATP,eATP)作为一种近年来新发现的植物细胞外信号已受到人们越来越多的重视。本实验采用拟南芥野生型col-0和多种突变体为材料,通过观察细胞外ATP对黑暗生长的黄化幼苗生长发育过程的影响,结合野生型和不同突变体对ATP处理所作出反应的差异,对于eATP的生理功能及其信号转导机制进行了进一步探索。
我们首先利用生理学实验方法,检测了外源ATP对于黑暗条件下生长的拟南芥幼苗生长发育的影响。结果显示,ATP处理条件下,暗生长的拟南芥幼苗下胚轴出现了显著的矮化、加粗、弯曲的现象,而且幼苗根的生长受到了严重的抑制。反应程度随着ATP浓度升高而加强,非水解的ATP类似物处理产生了同样的生理效应。结果表明,细胞外ATP作为信号分子调控了黄化拟南芥幼苗的生长发育。
为探究ATP影响黄化苗生长发育的生理机制,我们以生长素专一性启动子DR5-GUS转基因的拟南芥col-0材料,采用GUS染色技术检测了ATP处理后不同部位细胞内生长素含量和分布的情况。结果显示,ATP处理之后下胚轴细胞内生长素含量总体上高于对照组,而且在下胚轴两侧细胞内有明显的不均匀分布,推测eATP处理导致的生长素不均匀分布可能是胚轴弯曲生长的关键原因。我们还利用细胞壁专一性染料PI染色、结合激光扫描共聚焦显微技术观察了ATP处理后下胚轴弯曲处细胞和根尖细胞形态变化,结果显示ATP处理后胚轴弯曲点附近两侧细胞的长度差异显著,显示ATP处理导致了下胚轴不同部位细胞伸长生长的速度不同,从而最终引起了弯曲生长。
在植物生长发育过程,ROS、Annexin蛋白等信号组分参与了ATP信号转导途径,为了探索eATP调节拟南芥黄化苗过程中这些组分是否参与其中,我们利用拟南芥NADPH氧化酶根毛缺失突变体材料(kjl-2和rhd-2)以及Annexin蛋白基因缺失突变体Atann1及其恢复株系Atann1/ATANN1为材料,探究这些信号转导组分是否参与了eATP调控黄化幼苗生长发育的过程。结果显示,NADPH氧化酶突变体幼苗对于ATP处理不敏感,其基因缺失阻断了eATP的生理效应,推测ROS参与了eATP调控拟南芥黄化苗生长发育的过程。Annexin缺失突变体、恢复株系的幼苗对于eATP处理做出的反应与野生型一致,推测Annexin蛋白可能没有参与eATP调控黄化苗生长发育的过程。
乙烯合成前体ACC处理之后,幼苗生长发育指标的变化和ATP处理类似,推测乙烯合成可能是eATP诱发生理反应的一个环节。随后,为了探索乙烯及其信号转导组分是否参与了ATP调控拟南芥黄化幼苗生长发育的过程,我们利用乙烯受体ETR1基因功能缺失突变体etr1、乙烯信号转导的关键组分EIN2基因功能缺失突变体ein2、乙烯反应因子ERFy基因功能缺失突变体erfy为材料,对于eATP处理对各种材料的黄化幼苗生长发育的影响进行了检测。ATP处理后,etr1突变体、ein突变体和erfy突变体黄化幼苗的根长和胚轴弯曲度没有发生明显变化,这些信号转导组分基因突变导致了幼苗不能响应ATP刺激,说明ETR1、EIN2和ERFy都参与了eATP调控黄化幼苗生长发育的信号转导进程。
基于上述结果,我们推测eATP很可能通过某些信号转导组分(如ROS)诱导乙烯的合成,而后通过乙烯受体ETR1和乙烯信号转导组分EIN2来诱导乙烯反应因子ERFy,而后ERFy来调控下游的功能基因表达,最终实现对生长发育的调控。