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自1983年首次获得转基因烟草和马铃薯以来,经过二十余年的发展,植物基因工程的研究和发展非常迅速。植物转基因技术作为一种新型农业技术,带动全球性生物农业的大发展是大势所趋。但是,目前植物基因工程技术也有不少不足之处,如表达量低、表达不稳定、改变农作物的优良农艺性状等。其中种子特异性启动子的使用是解决此类问题的一个重要手段。
大豆β-伴球蛋白是大豆种子贮藏蛋白的重要组成部分。大豆β-伴球蛋白由α-、α-和β-亚基等三个亚基组成。本实验室在前期工作中通过PCR方法从大豆品种吉林43基因组DNA中分离到大豆β-伴球蛋白α-亚基基因启动子片段(BCSP501),两次TAILPCR之后获得了启动子片段BCSP952。序列分析表明,启动子片段BCSP952中含有种子特异性启动子所需的启动子序列元件:TATA盒、CAAT盒、A/T富含序列元件、RY重复序列元件、AGCCCA序列元件、TACACAT序列元件、ACGT序列元件、E盒等多种多拷贝的序列元件。为了进一步确定该启动子的核心序列元件,在序列分析的基础上我们设计了多个5缺失片段(BCSP156,BCSP285,BCSP471,BCSP666,BCSP952),以GUS基因为报告基因构建表达载体(PBB156-PBB952),以叶盘法转化烟草,转基因烟草的GUS酶荧光光度分析和组织化学检测均表明所有片段均只在种子中特异性表达GUS酶活性,并且在种子发育的中后期才开始大量表达。其中BCSP285的活性为BCSP156的3倍左右,而BCSP471的表达量为BCSP285的35倍以上,其它更长的片段与BCSP471的表达量没有明显差异。
为了进一步验证该种子启动子在植物基因工程中的应用前景。我们分别用这一启动子的BCSP666片段/35S启动子和高山被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(MAD6D)构建了表达γ-亚麻酸(GLA)的植物表达载体pCPNMA666和pCPNMA,转化烟草植株。在pCPNMA666的转基因烟草的种子当中检测到了4.36%的GLA,而在根和叶片当中没有检测到该产物。对照pCPNMA相反,在根和叶片当中检测到了GLA,而种子当中未检测到。