论文部分内容阅读
研究背景及目的：子痫前期是妊娠期特有的并发症，是导致孕产妇死亡的重要原因之一。其发病与滋养细胞功能异常有密切关系，但调控滋养细胞功能的机制尚不明确。有研究表明非编码RNA在调控细胞功能方面起着重要的作用。circRNA作为非编码RNA领域中新晋成员，其与子痫前期滋养细胞功能异常的关系值的探讨。本课题旨在研究circRNA在胎盘组织中的表达谱，发现并证实子痫前期异常表达的circRNA，研究异常circRNA对滋养细胞功能的影响，探索其调控机制，以期为阐释子痫前期发病机制提供新的研究方向，并为子痫前期的预测和治疗提供潜在的靶点。 方法：1）利用高通量测序技术对子痫前期和正常胎盘组织中RNA进行测序，并利用find_circ方法对读长进行序列分析，鉴定胎盘组织中circRNA表达谱。对鉴定出的circRNA，利用DeSeq2进行比对分析，发现在子痫前期胎盘中差异表达的circRNA。然后利用qRT-PCR在组织水平上对分析结果进行验证。随后利用生物信息学对验证的差异性circRNA进行GO分析和KEGG通路分析，发掘其可能的生物功能和参与调控的信号通路。2）针对hsa_circ_0007121的序列设计特异性的核酸探针，通过荧光原位杂交试验明确其在原代滋养细胞和HTR8/SVneo细胞中的表达定位。通过hsa_circ_0007121稳定表达的慢病毒转染HTR8/SVneo构建hsa_circ_0007121过表达细胞株，进行细胞增殖、流式凋亡、transwell等实验探索hsa_circ_0007121对滋养细胞的功能影响。3）利用生物信息预测软件对hsa_circ_0007121可能结合的miRNA进行预测，并利用qRT-PCR对预测结果进行验证。然后利用双荧光素酶活性检测及FISH共定位实验证实hsa_circ_0007121与其靶miRNA（miR-323-3p）的吸附作用。4）通过细胞功能获得和缺失实验证实hsa_circ_0007121与miR-323-3p之间的调控作用，并利用Western Blotting对miR-323-3p可能的靶蛋白进行验证。5）从孕妇中孕期（14-19周）外周血血浆中提取RNA，进行qRT-PCR实验，检测差异circRNA的表达水平。对检测结果进行受试者工作曲线分析（ROC），并与血浆中sFlt-1/PlGF，PlGF的预测效能进行比较，发掘circRNA作为预测子痫前期生物标志物的潜能。 结果：1）测序结果显示，胎盘组织中共检测出22796种circRNA。与正常胎盘组织相比，重度子痫前期胎盘共检测出300种异常表达的circRNA，包括151种高表达和149种低表达。qRT-PCR验证结果显示hg38_circ_0014736和hsa_circ_0015382在子痫前期胎盘组织中高表达，hsa_circ_0007121在子痫前期胎盘组织中显著下调。生物信息学分析显示这些异常表达的circRNA与预测到的靶miRNA及靶基因可能参与调节细胞增殖、缺氧应激、转录后调控等生物过程；KEGG通路分析也提示其在与子痫前期发病相关的通路如HIF-1，Wnt等信号通路方面呈现明显富集现象。2）FISH结果显示hsa_circ_0007121在原代滋养细胞以及HTR8/SVneo均有表达，且主要表达于细胞胞浆中。细胞功能试验显示，hsa_circ_0007121可影响HTR8/SVneo细胞侵袭能力，但对细胞增殖和凋亡无影响。3）生物信息学分析提示，hsa_circ_0007121含有多个miRNA结合位点并预测 hsa-miR-20a-5p，hsa-miR-29b-5p， hsa-miR-204-3p， hsa-miR-323-3p，和 hsa-miR-224-5p可能是其靶miRNA。qRT-PCR结果显示，只有 miR-323-3p的表达水平在hsa_circ_0007121过表达的细胞中明显下调。双荧光素酶活性检测结果显示，miR-323-3p mimics可以显著降低含有野生型结合位点的重组质粒的荧光素酶活性；而将结合位点突变后，miR-323-3p mimics不能改变重组质粒的荧光素酶活性。FISH共定位实验也显示两者存在共定位现象。4）细胞功能缺失与挽救实验以及Western Blotting实验提示， miR-323-3p同样影响HTR8/SVneo细胞的侵袭能力并抑制β-catenin的表达，而且这种影响可被hsa_circ_0007121逆转。并且通过shRNA沉默基因技术和细胞功能实验，证实β-catenin参与对HTR8/SVneo细胞的侵袭能力的调控。5）血浆RNA qRT-PCR结果提示子痫前期孕妇孕中期（14-19周）血浆中hsa_circ_0007121水平低于正常孕妇。ROC分析显示，hsa_circ_0007121预测子痫前期的曲线下面积为0.72（95%CI0.59–0.85），特异度和灵敏度分别为0.7，0.77。 结论：1）胎盘组织中存在大量的circRNA，且与正常胎盘组织相比，子痫前期胎盘组织中存在异常表达的circRNA。2）hsa_circ_0007121在子痫前期胎盘组织中显著下调，并且可通过吸附miR-323-3p影响β-catenin的表达参与对滋养细胞侵袭能力的调控。3）hsa_circ_0007121具有预测子痫前期的潜能。