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背景和目的结肠癌是一种常见的恶性消化系统肿瘤,在世界范围内均具有高发病率、高死亡率的特征,在我国结肠癌已成为致人死亡第3位消化道肿瘤。目前临床上仍采用手术为主、放化疗为辅的治疗方法来尽可能多地杀死肿瘤细胞,减少肿瘤细胞数量来达到治疗效果。然而高复发转移率及高耐药率使结肠癌术后5年生存率依然很低,这就使结肠癌早期诊断、早期治疗的研究显得尤其重要。因此在分子水平上对结肠癌的发生、发展机制的研究具有重要的现实意义和理论价值。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA。在人体内,lncRNA在基因内的分布非常广泛,虽然lncRNA并不编码蛋白质,但是其参与构成复杂且非常重要的基因表达调控网络,从而巧妙地调节基因表达。近来研究结果显示lncRNAs在正常组织发育以及调控细胞多能性和细胞分化的过程中起重要作用。此外,lncRNAs参与控制多种分子途径,引起基因表达改变,最终调控细胞增殖、凋亡与细胞迁移。因此lncRNAs的表达失调与人类多种疾病密切相关,比如肿瘤形成。人类全基因组测序结果显示,只有不到全部基因组2%的序列用于编码蛋白质,绝大多数非蛋白编码序列被转录成长度大于200个碱基的长非编码RNA(longnoncodingRNAs,lncRNAs)。但近年的研究表明,lncRNA 在表观遗传学水平及转录翻译调控癌基因和抑癌基因的表达,参与细胞增殖、迁移、侵袭等生物学过程,影响肿瘤的发生和发展,是肿瘤诊治及预后判断的潜在靶标。lncRNA NORAD 又名 LINC00657,定位于 Chromosome 20:36,045,622-36,050,960,长度为5339bp,包括一个外显子。目前关于NORAD的报道非常少,仅有相关生物信息学数据库提示NORAD在部分肿瘤中表达异常,提示lncRNA NORAD在肿瘤的发展进程中可能扮演了重要角色。我们的研究第一次综合分析了 lncRNANORAD在结肠癌中表达和生物学作用,并初步探讨了其对肿瘤调节作用的分子机制。本研究包括三部分:第一部分:结肠癌组织中lncRNA异常表达及与临床病理相关性分析;第二部分:调控lncRNA NORAD表达对结肠癌细胞HT-29增殖、迁移及侵袭的影响;第三部分:lncRNANORAD作用机制的初步研究。第一部分结肠癌组织中IncRNA异常表达及与临床病理相关性分析方法1.运用lncRNA基因芯片检测6例结肠癌组织及配对癌旁正常组织标本中lncRNA的表达情况。2.运用 RT-qPCR 检测 50 例标本中 4 种 lncRNA(NORAD,linc01154,nc-KRT7-2和lnc-ITGA5-1)表达水平,从组织水平验证lncRNA芯片结果的可靠性。3.运用RT-qPCR检测3株结肠癌细胞株(THC-8307、HT-29、HCT116)及正常人肠上皮细胞系FHC中lncRNA NORAD的表达水平,从细胞水平进一步验证lncRNA芯片结果的可靠性。4.依据lncRNA的表达水平,运用双变量相关性分析lncRNA NORAD与结肠癌病人性别、年龄、病理类型、分化程度、TNN分期、有无淋巴结转移及是否远端转移之间的相关性。结果1.结肠癌组织中筛选得到35个差异表达的lncRNA,其中在结肠癌组织中上调的lncRNA有20个(57.14%)和表达下调的lncRNA有15个(42.86%)。lncRNANORAD在结肠癌组织中表达显著增高。2.50例结肠癌组织及配对癌旁正常组织qRT-PCR结果显示,lncRNA NORAD,linc01154,nc-KRT7-2在结肠癌组织中表达显著高于癌旁正常组织(p<0.05);lnc-ITGA5-1在结肠癌组织中表达显著低于癌旁正常组织(p<0.05),表明用lncRNA检测芯片和RT-qPCR两种方法得到的结果具有很好的一致性,证实了芯片数据的可靠性。3.lncRNANORAD 在结肠癌细胞 THC-8307、HT-29、HCT116 的表达显著高于正常人肠上皮细胞系(p<0.05),进一步验证了 NORAD结肠癌表达水平显著增加。4.双变量相关性分析结果显示IncRNA NORAD表达水平与组织分化程度、淋巴结转移以及远端转移显著性相关(p<0.05),与病人年龄、性别、病理类型以及肿瘤TNM分期无显著相关性(p>0.05)。第二部分调控IncRNA NORAD表达对结肠癌细胞HT-29增殖、迁移及侵袭的影响方法1.制备下调lncRNA NORAD表达的重组慢病毒载体,感染对数生长期HT-29细胞,得到沉默lncRNA NORAD表达的HT-29细胞株。2.CCK-8实验和克隆形成实验检测沉默lncRNANORAD对HT-29细胞增殖能力的影响。3.粘附实验检测沉默lncRNANORAD对HT-29细胞粘附能力的影响。4.划痕实验和Transwell实验检测沉默lncRNANORAD对HT-29细胞迁移、侵袭能力的影响。结果1.成功构建pLVTHM-lncRNANORAD载体,测序及BLAST结果显示完全吻合;RT-qPCR结果显示,与对照组相比,转染lncRNA NORAD1组和lncRNA NORAD2组HT-29细胞的lncRNA NORAD表达水平显著下调(p<0.05),得到沉默lncRNANORAD表达的HT-29细胞株。2.CCK8实验结果显示:与对照组相比,转染后各时间点,SRC组细胞增殖能力无显著变化(p>0.05),NORAD1组和NORAD2组HT-29细胞生长在转染后12h后出现抑制(P<0.05),并且随时间的延长而日益显著。3.平板克隆形成实验结果显示:与对照组(56.5±10.7)相比,SRC组克隆数(52.4±7.4)无显著差异(p>0.05),NORAD1 组(20.1±3.9)和NORAD2组(23.3±7.3)的克隆数显著下降(p<0.05),表明沉默lncRNANORAD,HT-29细胞克隆形成能力受到显著抑制。4.粘附实验结果显示:各组细胞铺板90min后,与对照组(45.13±6.77)粘附率相比,SRC组粘附率(44.13±5.69)无显著差异(p>0.05),NORAD1组(25.12±4.48)和 NORAD2 组(25.01±6.72)粘附率显著下降(p<0.05),表明沉默lncRNA NORAD,HT-29细胞粘附能力受到显著抑制。5.划痕实验结果显示:与对照组相比,SRC组迁移细胞数无显著差异(p>0.05),NORAD1组和NORAD2组迁移细胞数显著下降(p<0.05),表明沉默lncRNANORAD,HT-29细胞迁移能力受到显著抑制。6.Transwell侵袭实验结果显示:与对照组(56.5± 10.7)相比,SRC组跨膜细胞数(52.4 ± 7.4)无显著差异(p>0.05),NORAD 1 组(20.1 ± 3.9)和 NORAD2组(23.3±7.3)的跨膜细胞数显著下降(p<0.05),表明沉默lncRNANORAD,HT-29细胞侵袭受到显著抑制。第三部分IncRNA NORAD作用机制的初步研究方法1.生物信息学预测与NORAD相互作用的靶基因2.利用RT-qPCR技术检测结肠癌组织标本中ETS-1的表达,并对其与临床病理特征进行相关性分析。3.利用下调ets-1慢病毒载体转染HT-29细胞,采用CCK-8实验、平板克隆实验、粘附实验、划痕实验及Transwell侵袭实验检测下调ETS1对结肠癌HT-29细胞增殖、迁移及侵袭的影响。4.利用Western-blot检测下调NORAD结肠癌细胞HT-29中uPA、MMP9表达的影响5.利用Westen-blot检测下调Ets-1结肠癌细胞HT-29中uPA、MMP9表达的影响结果1.对比癌旁正常组织,结肠癌组织中ETS1表达显著升高(P<0.05),经统计学分析显示结肠癌组织中ETS1的表达水平与结肠癌组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期及远端转移显著性相关,与病人年龄、性别及病理类型无相关性(P<0.05)。结肠癌组织中lncRNA NORAD和ETS-1表达存在正相关(R2=0.512),二者都显示出异常高表达的特征。2.下调结肠癌细胞HT-29中ETS-1表达抑制了细胞生长;对结肠癌细胞HT-29克隆形成能力、粘附能力、迁移能力及侵袭能力均有抑制作用。3.下调结肠癌细胞HT-29中ETS-1表达,能显著抑制了 MMP9、uPA的表达水平。4.下调lncRNA NORAD结肠癌细胞HT-29中ETS-1、MMP9及uPA的表达显著降低。结论1.结肠癌组织中筛选得到35个差异表达的lncRNA,其中在结肠癌组织中上调的 lncRNA 有 20 个(57.14%),下调的 lncRNA 有 15 个(42.86%)。lncRNA NORAD和ETS1在结肠癌组织中异常高表达,二者表达存在正相关,且组织分化程度、淋巴结转移以及远端转移显著性相关显著性相关。2.下调结肠癌HT-29细胞中lncRNA NORAD表达有效抑制结肠癌HT-29细胞增殖、迁移及侵袭能力。3.lncRNA NORAD可能通过影响ETS-1基因表达,进而调节uPA、MMP9表达水平,发挥其促进结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的生物学作用。