蛋白质的泛素化修饰是一个受到精密调控的级联酶促反应。蛋白质的泛素化可介导蛋白质降解,细胞增殖生长与分化,细胞免疫应答,细胞凋亡,细胞内膜蛋白的分选和运送等过程。蛋白质的泛素化修饰也是由去泛素化酶介导的一类可逆反应。细胞内蛋白质的去泛素化过程失调可导致诸如肿瘤等疾病的发生。USP37属于去泛素化酶家族的半胱氨酸水解酶家族,能够通过调控CyclinA蛋白稳定性调控细胞周期进程由G1期进入S期；USP37还能够调控PLZF/RARA蛋白稳定性进而参与到急性早幼粒细胞白血病的发生中。已有的报道也表明USP37的表达受到REST的调控,进而调控细胞周期调控蛋白p27的蛋白稳定性参与神经细胞增殖；可见USP37在不同组织细胞中通过调控不同的底物发挥作用,已有的研究表明,USP37在非小细胞肺癌中是高表达的,但是在肺组织中USP37的底物及其与肺癌发生的关系目前还不清楚。转录因子c-Myc在多种组织和种属中广泛表达,通过调控基因组15%基因的转录而参与到细胞周期调控,细胞代谢,细胞分化与衰老,蛋白质合成,线粒体功能等生命活动过程中。细胞内c-Myc功能失调会引起高达20%癌症的发生。c-Myc发挥转录因子作用主要是通过其N端转录激活结构域,协同bHLH结合蛋白MAX结合在包含特定DNA序列的基因启动子区而启动转录激活。细胞内c-Myc的蛋白表达水平调控除了受到MAX形成异源二聚体调控外,转录,mRNA稳定性,以及诸如磷酸化,乙酰化,泛素化等翻译后修饰也会参与调控c-Myc的表达。目前发现了调控c-Myc稳定性的多个 E3 泛素连接酶,包括Fbw7,SKP2,HectH9等,这些 E3 通过对c-Myc的K48位的多泛素化将其靶定到蛋白酶体降解。c-MycT58及S62位的磷酸化对其同Fbw7的结合并被其泛素化降解至关重要。相应地,c-Myc的去泛素化酶却只发现了USP28,并且USP28对c-Myc的蛋白稳定性调控是Fbw7依赖的,不能同Fbw7结合的c-Myc的突变体则不能被USP28稳定。但是,Fbw7在许多肿瘤中都是缺失或者突变的,那么这种情况下c-Myc的蛋白稳定性是如何被调控的,是否存在新的直接的去泛素化酶调控c-Myc的蛋白稳定性都还不清楚。此外,USP28对c-Myc的蛋白稳定性调控在肺癌细胞系中不成立的,那么在肺癌的发生过程中,是否存在去泛素化酶通过调控c-Myc蛋白稳定性参与肺癌的发生也不清楚。在本论文中,我们通过分子生物学,细胞生物学的实验方法,发现了能够直接调控c-Myc蛋白稳定性的新的去泛素化酶USP37。USP37以不依赖于Fbw7的方式同c-Myc直接结合,去泛素化c-Myc,进而通过调控转录因子c-Myc下游基因的转录激活参与到c-Myc介导的肺癌细胞增殖和瓦博格效应等生物学过程中。另一方面,我们利用生物信息学及免疫组织化学染色的实验方法,对大量的肺癌病人组织样本分析得出,USP37由于可能受到较低甲基化调控使其在肺癌中特异性高表达,且其表达同c-Myc的表达有很好的正相关性。我们的研究为肺癌的临床治疗和相关药物开发提供很好的药物靶标和可靠的理论基础。本论文主要包括以下几部分：一.c-Myc新的去泛素化酶USP37的鉴定我们在肺癌细胞系H1299中过表达若干去泛素化酶,筛选到去泛素化酶USP37显著稳定内源c-Myc, USP37对c-Myc的调控是剂量依赖的,并且依赖于USP37的去泛素化酶活性。接着我们利用实验室的LPDS双系统验证同荧光素酶融合的c-Myc也能被USP37稳定,而活性缺失的USP37C350S却不具有这种作用。在H1299细胞中,过表达USP37后,内源c-Myc的半衰期明显延长,表明USP37对c-Myc的蛋白稳定性调控发生在翻译后修饰水平。上述实验结果表明,去泛素化酶USP37在过表达的条件下稳定c-Myc的蛋白稳定性,而且这种作用依赖于USP37的去泛素化酶活性。二.USP37在肺癌细胞中调控c-Myc稳定性的分子机制研究1.USP37对c-Myc蛋白稳定性的机制研究USP37被干扰低表达时肺癌细胞中内源c-Myc的蛋白水平也随之明显减少,而c-Myc的RNA水平并没有明显的变化,这表明USP37对c-Myc的蛋白稳定性调控发生在翻译后水平。接下来的pulse-chase实验发现USP37被干扰低表达后,内源c-Myc的半衰期明显缩短。进一步利用refeed的模型,将处于低血清浓度的细胞重新加入新鲜培养基,观察一段时间内内源c-Myc蛋白水平的变化,结果表明,在refeed的过程中,c-Myc的蛋白稳定性持续受到USP37的调控。2.USP37与c-Myc的相互作用通过免疫共沉淀试验,我们发现USP37在体内外同c-Myc直接结合。免疫荧光的实验得出USP37和c-Myc共定位在细胞核中。Pull Down实验证明USP37在体外可以同c-Myc直接结合。我们还构建了c-Myc的分段克隆,利用免疫共沉淀实验,发现c-Myc的包含MBⅢ的中心段同USP37结合,并且缺失这一段的突变体不能被USP37稳定。3.USP37去泛素化c-Myc通过Ni-NTA的方法表明,USP37可显著去泛素化c-Myc,而USP37C350S则不能。进一步在H1299细胞中干扰内源USP37,检测内源c-Myc的泛素化水平,发现USP37低表达时,c-Myc的泛素化水平明显上调。c-Myc的泛素化水平能够明显被USP37纯蛋白减弱。上述结果表明,c-Myc在肺癌细胞中的蛋白水平受蛋白酶体的调控；体内和体外实验证明,USP37能够直接同c-Myc结合并去泛素化c-Myc进而对其稳定性进行调控。三.USP37在肺癌细胞中调控c-Myc稳定性的相关生物学功能研究1.USP37促进c-Myc介导的肺癌细胞的增殖通过MTT实验及克隆形成实验得出H1299细胞中干扰siRNA使USP37低表达时,能显著抑制肺癌细胞的增殖。但是当同时干扰掉c-Myc的表达,再利用MTT及克隆形成的增值实验,发现USP37仍然能够抑制肺癌细胞的增殖,但是同时敲除c-Myc时,肺癌细胞的增殖情况并无明显变化。这些结果证明了USP37通过影响c-Myc而影响肺癌细胞的增殖。2.USP37促进c-Myc介导的瓦伯格效应在H1299中分别干扰USP37,c-Myc及同时干扰USP37和c-Myc,检测葡萄糖摄取量及乳酸生成量。当USP37下调时,葡萄糖摄取量及乳酸生成量明显下降。而同时干扰USP37及c-Myc时,这两项指标并无明显变化。证明USP37对反应瓦伯格效应的两项指标葡萄糖摄取量及乳酸生成量的影响是通过调控c-Myc的蛋白表达量实现的。同时我们检测了位于c-Myc下游的受转录因子c-Myc调控的两个瓦伯格效应相关基因LDHA及Glut1的表达,结果表明,干扰USP37可使位于c-Myc下游的瓦伯格效应相关蛋白Glut1及LDHA下调。上述结果表明,USP37能以去泛素化酶活性依赖的方式促进c-Myc介导的肺癌细胞的增殖。USP37通过稳定c-Myc的蛋白表达,上调位于转录因子c-Myc下游的瓦伯格效应相关基因LDHA及Glut1而调控瓦博格效应。四.USP37在肺癌病人组织样品中同c-Myc表达相关性的研究通过免疫组织化学实验,分析了肺癌病人的肺癌组织及癌旁组织中USP37的表达情况。结果表明,在高达69%的包括肺鳞癌和肺腺癌的肺癌病人样本中USP37在肺癌组织中特异性高表达。接着我们分析了TCGA数据库里在肺癌病人组织样品中,USP37同转录因子c-Myc下游的调控基因CNNB1的表达有很好的正相关性。接着分析了TCGA数据库中多例肺癌组织中USP37基因甲基化水平,结果发现,USP37在肺癌组织中的高表达是由于其基因较低的甲基化水平造成的。进一步我们利用免疫组织化学的方法分析了肺癌组织中USP37表达同c-Myc表达的相关性,实验结果表明,USP37的表达同c-Myc的表达在肺癌病人组织样品中有很好的正相关性。上述结果表明,去泛素化酶USP37在肺鳞癌及肺腺癌病人样品中特异性高表达,且USP37的基因表达收到甲基化调控,在肺癌病人组织样品中,USP37的高表达是由于其较低的甲基化水平造成的。免疫组织化学实验结果表明,USP37的蛋白表达同c-Myc的蛋白表达具有很好的正相关。