洋葱(Allium cepa L.,染色体数2n=2x=16)是百合科(Liliaceae)葱属(Allium)二年生蔬菜,在世界范围内栽培广泛,其年生产量和生产面积居于世界蔬菜生产的第三位。我国种植洋葱的历史虽然较短,但是发展迅速,在全国各地广泛栽培,是重要的出口创汇蔬菜。洋葱是典型的异花授粉蔬菜,自交衰退严重。传统育种方法育成优良的自交系需要6~10年的时间,而通过单倍体途径在较短时间内就可以选育出整齐一致的纯系,明显提高选择效率。此外,单倍体加倍获得的双单倍体可作为重要性状的遗传分析、分子标记及数量性状研究的理想材料。本研究以不同来源的中日照型洋葱自交系、常规种、杂交种为材料,通过离体雌核发育途径诱导培养洋葱花蕾,对适宜培养基的筛选、培养程序优化、植株再生、染色体倍性鉴定、染色体加倍技术、分子标记鉴定等进行了研究。利用获得的洋葱不育双单倍体、可育双单倍体以及二者杂交获得的F1,采用SLAF-seq技术进行测序,获得多态性SLAF标记,并开发出大量特异性SNP位点。主要结果如下:1.以引自日本的3个中日照型洋葱杂交种的花蕾为外植体材料,研究了2,4-D和6-BA浓度及配比对单倍体诱导培养的影响。结果表明,含有1.5 mg·L-1 2,4-D+1.5 mg·L-1 6-BA和2.0 mg·L-1 2,4-D+2.0 mg·L-1 6-BA的B5培养基适于胚的诱导,诱导率最高达到4.00%。2.对洋葱花蕾的诱导培养程序进行了优化研究,结果表明不同花蕾大小对洋葱的离体雌核发育有很大影响。直径2.1~3.0 mm的花蕾离体诱导培养时成胚率明显低于其它直径的花蕾。直径3.1~4.0 mm的花蕾诱导成胚率最高。‘地球’的花蕾经低温预处理1 d后成胚率明显增高,预处理3 d后胚的诱导率开始明显下降。而‘大宝’的花蕾经低温预处理1 d后成胚率没有显著变化,预处理3 d后胚的诱导率明显下降。3.不同基因型洋葱雌核发育胚的诱导率存在很大差异。本试验供试的9个洋葱基因型中胚的诱导率最高的是杂交种‘地球’,诱导率为4.67%,其次为‘大宝’和‘阿盾’,诱导率分别为4.33%和4.00%,没有显著差异。2个常规种‘天正红玉’和‘天正黄金’分别诱导出了6枚和8枚胚,诱导率显著少于其他基因型。2个自交系503和217分别诱导出13枚和10枚胚,诱导率显著大于常规种,但显著少于5个杂交种。总的来说,杂交种的胚诱导率大于自交系,自交系的诱导率大于常规种。4.将所获得的雌核发育胚转移至含有30 g·L-1蔗糖的1/2B5+0.5mg·L-1NAA培养基中,5d后即可发育成正常植株。利用流式细胞仪对所获得的再生植株进行dna相对含量测定,结果显示正常二倍体的样品分离峰出现在140相对荧光强度中,据此断定分离峰出现在70荧光强度的为单倍体材料。为进一步验证再生植株的倍性,对通过流式细胞仪鉴定过的植株再进行根尖染色体计数分析,结果表明经鉴定为二倍体的植株染色体数为2n=2x=16,鉴定为单倍体的染色体数为n=x=8,与流式细胞仪的鉴定结果完全吻合。5.研究了秋水仙素不同浓度、不同处理时间对单倍体植株染色体加倍效果的影响。结果表明,在处理时间相同的情况下,随着秋水仙素浓度升高,再生植株的存活率降低,但二倍体率增加;在相同秋水仙素浓度下,随处理时间延长,植株的成活率下降,但二倍体率增加。浓度为200mg·l-1的秋水仙素处理48h,对两个供试品种的染色体加倍效果最好,成活率分别为61.11%、50.00%,加倍率分别为44.44%、38.89%。6.利用dnf-566、rns-357和acskp1标记对部分再生植株进行了检测。‘阿盾’的11株再生植株均为纯合的msms或msms,‘地球’的15株再生植株中在ms位点的基因型均为纯合的。‘大宝’的16株再生植株中,有13株在ms位点的基因型均为纯合的,3株是杂合的。7.生根良好的再生植株经驯化、炼苗后,移栽到试验基地网棚,绝大多数再生植株成活,形态正常,生长发育良好。洋葱单倍体植株矮小、细弱,开花期与二倍体洋葱植株基本一致,但抽生花薹矮小。整个花序较小,花蕾数少而且小。花药小,没有花粉。双单倍体植株性状表现符合二倍体特征,能正常开花。经分子标记鉴定为msms基因型的双单倍体植株育性正常,而鉴定为msms基因型的双单倍体植株表现为雄性不育。育性正常的双单倍体植株开花后套袋,放入苍蝇授粉自交,获得了发育饱满、发芽力强的自交种子。对不育双单倍体植株,利用其作为母本与可育双单倍体杂交,获得了f1代种子。8.以获得的可育双单倍体dh-17、不育双单倍体dh-1及部分f1代单株为材料,利用基于简化基因组深度测序的slaf-seq技术,选择洋葱转录组作为参考进行电子酶切预测,最终确定使用pvuii+scai酶切。将南芥的测序读长与参考基因组的比对结果显示双端比对效率为80.60%,大部分测序读长的插入片段长度都在范围之内,表明建库质量良好。通过测序共获得125.98m读长,各样品所获读长数量在29736~30825419范围内。所有样品的测序质量值q30均大于80%,说明测序碱基错误率较低,所获数据合格。测序获得平均gc含量为35.77%,而且含量比较平均,说明达到了测序要求。对满足质量要求的测序数据进行聚类分析,共开发出各类型标签294911个,其中多态性SLAF标签14776个,仅占SLAF标签总数的5%。根据基因型编码规则对筛选出的多态性标签进行基因型编码,共得到可编码8种基因型的标签6384个,其中5354个多态性标签符合aa×bb类型,占可编码标签的83.86%。利用多态性标签进一步进行SNP位点的开发,共得到36109个群体的SNP。样品亲缘关系鉴定结果表明异常标签数目所占比例均远远小于0.5%,由此可以判定样品F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5均为DH-17和DH-1的子代。