乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是呈世界性流行,据世界卫生组织统计,全球大概有3.5亿HBV携带者,其中约有10%发展为慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)进而发展为肝硬化、肝衰竭以及原发性肝癌等严重的并发症,每年约有28万人死于HBV感染相关性疾病。HBV cccDNA又称乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA,是HBVDNA复制的中间体,亦是HBV前基因RNA复制的模板,只有彻底清除HBV cccDNA,才能真正清除乙肝病毒,因此HBV cccDNA的检测对研究乙型肝炎致病机制和评价抗病毒药物的疗效及新药的研发等方面具有重要的意义。利用PSAD(质粒安全ATP依赖DNA酶)消化、原位滚环扩增(RCA)等方法进行原位PCR检测肝组织中的HBV cccDNA是目前来说较新的一种原位PCR方法,与液相PCR相比不需从肝组织中提取DNA只需在组织切片上即可进行原位扩增,与southern相比,不需要电泳、转膜等一系列复杂的操作步骤,与原位杂交相比,可以将低拷贝的HBV cccDNA通过扩增检测出来,与传统的一步原位PCR方法相比较,由于经过PSAD消化处理去除了非cccDNA的影响以及原位RCA只扩增cccDNA,再加上特异性标记跨的缺口引物扩增,使敏感性和特异性均得到了提高,而且还可以在分子水平上将组织形态与基因定位、分布状态较好地联系起来,还可进一步了解HBVDNA的复制能力,不但可以为临床抗病毒治疗提供指导,而且为乙型肝炎的病理学研究提供了适宜的手段。目的：利用新型原位聚合酶链反应检测肝组织中的HBV cccDNA,明确HBV cccDNA在肝组织中的分布状况,为进一步研究HBV cccDNA在乙型肝炎的致病机制及探讨乙肝治疗的新途径提供分子病理学基础。方法：1、收集30例乙型肝炎、乙肝后肝硬化及肝癌患者的石蜡包埋组织切片,采用同一石蜡包埋肝组织连续切片进行HE染色,并对染色结果进行炎症活动度与肝纤维化程度分级分期,并对每一个石蜡包埋的肝组织进行HBsAg和HBcAg免疫组织化学染色.2、将肝组织切片进行防脱及通透化处理后采用PSAD消化,为证明PSAD的作用,我们将切片PSAD消化前后采取同一种扩增方法的两张切片进行对比,通过对有无PSAD消化的两种原位PCR对比,来突出本方法的优势,证明PSAD去除松弛的环状HBVDNA及其他形式的DNA,从而增加了检测的特异性。3、为进一步验证滚环扩增的效果,取两张同一肝组织连续切片分别进行PSAD酶消化后采用半套式原位PCR检测和滚环扩增加上跨缺口的原位PCR检测,对两种方法的图像结果进行对比分析,评价两种方法的敏感性与特异性,从而判断新型原位PCR方法的敏感性和特异性,探讨其应用价值。结果：1、30例HBV感染患者组织切片病理学分级、分期为G1-4S0-4,诊断为慢性乙型肝炎23例、肝硬化患者1例,肝癌患者6例；免疫组化HBsAg,]阳性为26例,HBcAg,阳性为18例2、应用新型原位PCR检测肝组织中HBV cccDNA,30例组织切片有20例为HBV cccDNA阳性,阳性检出率67%,组织切片阳性表达率为平均35%-70%。以核型为主,呈蓝色、紫色或紫蓝色,呈颗粒状、弧形或圆形团块状,主要在核及核膜上分布。3、将切片PSAD消化前后采取同一种扩增方法的两张同一肝组织切片进行对比发现使用PSAD消化的切片,扩增的HBVcccDNA阳性颗粒较明显,未使用PSAD消化的肝组织切片上扩增的阳性颗粒不明显,说明PSAD去除了部分非cccDNA的干扰,使特异性和敏感性均得到了提高。4、应用新型原位PCR检测肝组织中HBV cccDNA与同一连续切片的半套式原位PCR方法相比,扩增的基因点较集中,颗粒扩散范围较小,因此特异性更高。与传统的一步原位PCR相比,新型原位PCR能检测到传统原位PCR检测不到的HBV cccDNA阳性颗粒,因此敏感性更强。5、阴性患者及阴性对照肝细胞胞核为红色,未见HBVcccDNA阳性颗粒。6、总计30例检测患者中,6例慢性乙型肝炎患者、1例酒精性肝硬化合并乙肝肝硬化静止期的患者、1例肝癌和1例乙肝慢性重症患者的组织切片中出现HBVcccDNA强阳性信号,慢性乙肝轻型和慢性乙肝中度患者组织细胞阳性表达率明显低于乙肝慢性重症、肝硬化和肝癌病。7、HBcAg阳性的肝组织切片检测HBV cccDNA结果均为阳性。8、肝组织中HBV cccDNA阳性结果的出现与血清中HBVDNA的含量有相关性。血清HBVDNA的含量大于106Copies/ml,检出率高。新型PCR方法可以检测到血清HBVDNA的含量低于102Copies/ml肝组织样本。结论：新型原位PCR用于检测肝组织中HBVcccDNA,具有敏感性高、特异性强的特点,对研究乙型肝炎致病机制和评价抗病毒药物的疗效具有重要的临床意义和应用价值。