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研究背景糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是I型糖尿病和II型糖尿病并发症,是导致失明的重要原因之一。DR与视网膜毛细血管周细胞(以下简称周细胞)的丧失密切相关,而周细胞丧失主要由周细胞凋亡导致。周细胞是外血-视网膜屏障(outer blood-retinal barrier,oBRB)的重要组成部分,起到支撑血管作用。早期DR周细胞在病理改变上可见核面积增加,核着色变浅,密度不均匀,形态不规则,随后周细胞丧失,血-视屏障破坏。甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)是糖酵解3一磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPD)的中间产物,过量的MGO是生成是导致周细胞损害的主要因素之一。中药黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.)又名绵芪,为多年生草本植物,具有抗衰老、抗应激、降血糖等作用。黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)是中药黄芪的主要成分之一,有“超级黄芪多糖”之称。AS-Ⅳ具有免疫调节、器官保护、抗凋亡、降血糖、抗衰老等多种功效,因此AS-Ⅳ可能对MGO损伤的视网膜周细胞具有保护作用。实验目的研究AS-Ⅳ对MGO诱导的视网膜血管周细胞损伤的保护作用,并探讨其作用机制。实验方法(1)视网膜血管周细胞损伤模型的建立:给予视网膜周细胞不同浓度的MGO(400、600、800、1000和1200μM)诱导损伤,用CCK-8细胞检测试剂盒检测细胞存活率,确定造模的给药时间和给药浓度。(2)AS-Ⅳ对MGO诱导损伤的视网膜血管周细胞的影响:确定造模条件后,给予细胞不同浓度的AS-Ⅳ预作用2h,然后加入造模条件的MGO,孵育6h后,检测细胞存活率,确定后续实验中AS-Ⅳ的最适浓度。(3)氧化应激及细胞凋亡检测:在细胞内装载荧光探针检测细胞内ROS的水平。用荧光染料Hoechst 33342作用于周细胞后,拍照观察细胞形态和着色强度检测细胞凋亡程度。(4)凋亡相关蛋白电泳及ELISA检测:以Western Blot法检测细胞凋亡的相关蛋白Bcl-2、Bax,利用ELISA法检测Caspase家族蛋白(包括Caspase-3和Caspase-9)的表达水平。实验结果1、造模与AS-Ⅳ保护能力:MGO能够降低周细胞的活力,且呈剂量依赖性,当MGO孵育6 h,浓度为800μM时,细胞活力为64%左右。以此为最佳MGO造模浓度和最适孵育时间,建立周细胞损伤模型。当预给予AS-Ⅳ后,周细胞的活力明显上升,表明AS-Ⅳ能够抑制MGO诱导的周细胞损伤。当AS-Ⅳ浓度达10μM时细胞存活率达到峰值,且与模型组比较有显著性差异。2、细胞内ROS水平检测:模型组的ROS产生明显增多,荧光强度明显高于对照组,数据呈显著性差异。给予AS-Ⅳ后荧光强度降低,与模型组比较呈显著性差异,表明AS-Ⅳ能够降低细胞内ROS的产生。3、AS-Ⅳ对MGO诱导的周细胞凋亡的影响:Hoechst 33342染色显示,对照组周细胞被着色成均匀的淡蓝色,染色质均匀分布于细胞核内,且细胞核形态呈长椭圆状。MGO处理细胞后,细胞核发生明显改变,形态皱缩破碎,染色质聚集,且着色不均匀,有密集的亮蓝色斑点。AS-Ⅳ给药后,给药组细胞与模型组比较,细胞核形态明显恢复,细胞内密集的蓝色亮斑减少,表明AS-Ⅳ能显著改善MGO对周细胞的损伤,具有一定的抗凋亡作用。4、凋亡相关蛋白电泳及ELISA检测:Western Blot显示,与对照组相比,MGO组的抗凋亡蛋白Bcl-2表达量降低,促凋亡蛋白Bax表达上升。给予AS-Ⅳ后,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平上升,且促凋亡蛋白Bax表达水平降低,从而提高了Bcl-2/Bax比例。ELISA法检测Caspase家族蛋白显示,与对照组比较,MGO组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平升高,给予AS-Ⅳ后Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平明显下降,表明MGO引起的周细胞凋亡被明显抑制。实验结论黄芪甲苷(AS-Ⅳ)能够通过抑制ROS的产生,调节机体内Bcl-2和Bax表达水平,调控Casepase家族蛋白(Caspase-3和Caspase-9)的表达水平,从而抑制视网膜周细胞凋亡,表明AS-Ⅳ具有保护视网膜周细胞的作用。