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纳他霉素(Natamycin)属于二十六元多烯大环内酯类抗生素,是一种高效、广谱的抗真菌剂。由于纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低,现已在食品、医疗等领域得到广泛应用。但目前国内外纳他霉素发酵的水平较低,且成本较高,应用前景受到很大限制。因此,有必要对纳他霉素的发酵进行深入的研究和开发。本文围绕如何提高纳他霉素的产量和质量,对生产菌种的选育、纳他霉素的发酵工艺和产品纯化等方面进行了研究,具体内容如下:
⑴以褐黄孢链霉菌ATCC13326为出发菌株进行摇瓶发酵,其纳他霉素的发酵产量为2.68 g/L。经琼脂块法筛选获得一株高产菌株(54号),其摇瓶发酵产量为2.95 g/L,将该菌株进行链霉素抗性筛选,最终选育出一株高产纳他霉素的突变株N-24。该菌株在未优化条件下的纳他霉素摇瓶发酵产量为3.52 g/L,比54号出发菌株的发酵产量提高了19.3%。经验证,菌株N-24的遗传性能十分稳定。接着考察了种龄、接种量、发酵培养基初始pH、温度、装液量及添加前体等对褐黄孢链霉菌N-24摇瓶发酵合成纳他霉素的影响。经优化确定最适培养条件为:接种时间为40~44h,接种量为10%,初始pH7.3,温度28℃,装液量为30 mL/300mL,转速200 rpm,培养时间为120 h,在发酵24 h时加入0.6%的丙酸钠。该条件下菌株N-24摇瓶发酵生产纳他霉素的产量可达到6.87 g/L,比其未优化条件下的产量(3.52 g/L)提高了95.2%。
⑵以菌株N-24为生产菌株,进行了10 L发酵罐放大研究。发酵罐中的纳他霉素产量可达8.34 g/L,比摇瓶发酵产量(6.87 g/L)提高了21.4%。以10 L发酵罐发酵的实验条件为依据,进行了50 L发酵罐放大研究,其产量为8.0 g/L。
⑶对纳他霉素的提取工艺进行了研究。确定的最佳提取条件为:加入6倍质量于干菌丝的75%乙醇,pH11,37℃萃取5h。二次提取后萃取液中纳他霉素提取收率为90.4%。萃取液经过活性炭脱色后,将pH值调整至5.5~5.7之间,在10℃结晶24 h,其结晶率达到80%,最终纳他霉素收率达到70%左右。成品中纳他霉素的含量为90.2%。