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目的: 通过观察川崎病患儿急性期血清、恢复期血清和正常儿童血清对人脐静脉内皮细胞的凋亡和趋化因子及其受体表达的影响,探讨川崎病血清和趋化因子在川崎病患儿冠状动脉损伤中的作用及其可能的机制。 方法: 1.细胞培养体外培养HUVECs。 2.血清制备分别采集5例在我院明确诊断为典型川崎病患儿急性期(发热7d内)、静脉丙种球蛋白治疗后(川崎病恢复期)及本院门诊体检、年龄相仿的正常健康儿童静脉血各4 mL。4℃4000转/min离心15min,-80℃冻存待用。实验前将血清置于4℃解冻,分组合并为川崎病急性期血清组、恢复期组及正常儿童血清组,所有血清使用0.22μm微孔滤器过滤后除菌。 3.实验分组用含10%的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640正常培养HUVECs,根据培养条件不同分为4组:(1)川崎病急性期血清组(KD1):HUVECs+川崎病急性期血清+ RPMI-1640培养基;(2)川崎病恢复期(丙种球蛋白治疗后)血清组(KD2):HUVECs+川崎病恢复期血清+RPMI-1640培养基;(3)正常血清组(N):HUVECs+正常儿童血清+RPMI-1640培养基(4)空白对照组(Con):HUVECs+ RPMI-1640培养基。 4.细胞增殖与凋亡的检测 CCK-8和流式细胞术分别检测各组血清对内皮细胞增殖和凋亡的影响。 5.凋亡相关蛋白检测各组干预因素加入细胞24h后应用蛋白印迹技术(Western blot)检测各组HUVECs中凋亡相关基因Caspase-3蛋白的表达情况。 6.趋化因子及其受体基因表达水平的检测各组干预因素加入细胞后24h后应用qPCR荧光定量技术检测各组细胞内趋化因子及其受体mRNA表达情况。 结果: 1.应用CCK-8法测定各组血清对HUVECs增殖的影响,发现KD1组、KD2和N组的OD值分别为(0.64±0.10、0.81±0.06、0.92±0.08),计算各组抑制率,差异均具有统计学意义(P<0.05)。 2.应用流式细胞术检测KD1、KD2和N组的细胞总凋亡率,发现各组的凋亡率相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。 3.含血清浓度为10%的各组诱导HUVECs时,KD1组和KD2组与N组相比,Caspase-3蛋白表达明显增多(P<0.05);而且KD2和N组比亦具有显著性的差异(P<0.05)。 4.趋化因子及其受体mRNA检测结果:与KD1组相比,KD2组和N组的ADAM17 mRNA的表达量均减少(P<0.05),并且随着浓度的增高而增高;但KD2组mRNA的含量与N组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。 结论: 1、川崎病急性期血清具有抑制HUVEC增殖、促进HUVEC凋亡的作用。 2、川崎病急性期血清促进HUVEC凋亡的机制可能与上调Caspsae-3蛋白的表达相关。 3、川崎病急性期血清刺激血管内皮细胞分泌ADAM17表达增加且作用具有浓度依赖性。