三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)广泛分布于中国、日本及朝鲜等海域，是世界重要的海产蟹类，己成为我国重要的海水养殖品种之一。2011年，我国三疣梭子蟹养殖总产量超过10万吨。近年来，随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高，由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重，给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。深入开展三疣梭子蟹免疫防御机制相关研究，探索免疫防治新途径，是减少疾病发生、实现健康养殖的可靠保障。目前的研究结果表明，丝氨酸蛋白酶抑制剂在无脊椎动物的免疫应答中发挥重要作用，它通过与丝氨酸蛋白酶的协同作用调节信号转导和级联放大，并可导致非特异性的免疫防御机制的激活和抗菌肽的合成[1,2]。本研究以构建的三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库为基础，通过对表达序列标签（EST）进行序列分析，从中鉴定出3种丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPIs）基因，包括PtPLC（pacifastin型）、PtSerpin（serpin型）和PtKPI（kazal型）。利用cDNA末端快速扩增（RACE）、实时定量PCR、基因原核重组表达等技术系统研究三疣梭子蟹三种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，分别获得其cDNA全长序列，揭示三种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的分子结构特点、组织分布特点、对微生物的响应机制及功能，初步探讨它们在三疣梭子蟹免疫防御中的作用。PtPLC的cDNA序列全长1655bp，其中5′非编码区（Untranslated Region,UTR）为33bp，3′UTR524bp，有一个典型的多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和一个ployA尾巴，开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有1098bp，编码365个氨基酸残基。分子量为40.51kDa，等电点为5.04。对其推测的氨基酸序列进行分析，发现其中包括17个氨基酸残基组成的信号肽序列和8个pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂轻链结构域（pacifastin light chain domain, PLD）。每个结构域都由6个半胱氨酸组成，基本结构为Cys-Xaa9-12-Cys-Asn-Xaa-Cys-Xaa-Cys-Xaa2-3-Gly-Xaa3-4-Cys-Thr-Xaa3-Cys。PtSerin全长1593bp，开放阅读框含有1227bp，编码408个氨基酸残基。分子量为45.05kDa，等电点为7.23。预测的三级结构由3个β折叠和9个α螺旋组成。多序列比对结果显示，PtSerpin与拟穴青蟹（Scylla paramamosain）的serpin型基因SpSerpin具有极高的相似性。系统进化树的分析结果表明，PtSerpin与同为甲壳动物的拟穴青蟹、斑节对虾（Penaeus monodon）和水蚤（Daphnia pulex）的serpin型基因同源性较高，聚为一支。PtKPI cDNA全长683bp，其中5′UTR为36bp，3′UTR203bp，开放阅读框444bp，编码147个氨基酸残基。分子量为15.85kDa，等电点为8.99。氨基酸序列分析表明，有一个编码16个氨基酸残基的信号肽和一个kazal结构域。Kazal结构域的典型结构为C-X3-C-X7-C-X6-Y-X3-C-X7-C-X12-C，预测的空间结构包含一个α螺旋和3个β折叠。三个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在健康三疣梭子蟹各个检测组织中均有表达，这些组织包括血细胞、鳃、眼柄、肝胰腺、肌肉、心脏和胃，但是呈不同的表达模式。PtPLC和PtSerpin基因在血细胞中的表达量最高，其次在鳃中表达量较高；PtKPI基因在眼柄和血细胞中表达量较高。在三疣梭子蟹受到溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）及毕赤酵母菌（Pichia pastoris）刺激后，三种丝氨酸蛋白酶抑制剂mRNA水平随着时间的不同均呈现不同的表达模式，提示丝氨酸蛋白酶抑制剂是清除入侵病原菌的应答因子和效应因子。并且，三种丝氨酸蛋白酶抑制基因在受到真菌刺激后，反应更早更剧烈，说明丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在抵御病原微生物入侵方面具有不同的防御机制。将PtPLC和PtSerpin基因分别导入表达质粒，通过体外原核重组表达技术，得到有活性的蛋白，并通过体外孵育手段，分别检测了两种蛋白与牛胰蛋白酶及牛胰凝乳蛋白酶的作用活性。PtPLC对牛胰蛋白酶及牛胰凝乳蛋白酶都有不同程度的抑制作用，而PtSerpin对两种丝氨酸蛋白酶都没有抑制活性。以上研究结果揭示三疣梭子蟹酚氧化酶相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂的分子基础、组织分布特点、对微生物的响应机制及蛋白活性，为全面理解丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构和功能奠定了基础。